肾透明细胞癌(clear cell renal cell carcinoma, ccRCC)是一种常见的肾癌类型，与其它的RCC相比，其预后(prognosis)和患者结局(patient outcomes)较差。为患者实施最佳治疗方案通常需要准确诊断ccRCC。基于显微组织学图像诊断ccRCC的方法已经得到了广泛研究。通常，使用苏木精和曙红(H&E)等染色试剂，利用明场显微镜来观测ccRCC载玻片上的细胞形态。尽管H&E染色在明场显微镜下能直接可视化细胞核和细胞质的形态，但该方法是定性评估，且固有地受观察者自身偏差和观察者之间差异的影响。定量观察手段对于避免这些误差至关重要。
定量相位成像(quantitative phase imaging,QPI)技术是一种无标记的定量成像方法，已经在量化组织切片的组织病理学特征上显示出其潜力。QPI凭借不使用外部标记源的情况下提供样本的光学相位延迟的优势，已经被用于研究各种组织切片。如前列腺癌、结肠癌、乳腺癌、阿尔茨海默病、克罗恩病、盆腔器官脱垂等都使用QPI技术进行了相关研究。此外，三维QPI技术能够量化组织病理学标本的三维折射率分布。在三维QPI技术中，基于强度的三维QPI技术最近已成为不使用干涉术对生物系统进行成像的有效工具。
基于此，韩国KAIST的Juyeon Park(一作)和YongKeun Park(通讯)等人提出了一种利用染色图像和折射率层析图像的相关方法，证明了对从人类患者获得的ccRCC切片的结构异质性的定量评估。并结合机器学习辅助细胞核和细胞质分割，实现亚细胞层级的定量分析。试验过结果表明，与良性区域相比，恶性区域的结构异质性显著增加。
(1)利用自干涉光学衍射层析的多元有效模式(plural efficient patterns for self-interfering ODT, PEPSI-ODT)测量三维折射率分布。实行ODT时，用455nm波长LED照射DMD作为光源，照明模式被DMD调制(DMD置于傅里叶平面)。如图1b和c，在４个不同照明模式下采集４张强度图，并结合理论估计的点扩散函数通过反卷积重建出折射率图(二维QPI测量光学相位延迟，不具备光学切片能力，可能会由于样品的不均匀面而产生伪影。三维QPI则不然，但是它由于需要轴向扫描，耗时变长)。
(2)RGB三色合成明场彩色成像。额外使用520nm和624nm波长的LED分别照射样品，结合455nm照明，合成彩色的明场染色图。
(3)三维平铺(tiled)成像。每张折射率和明场图像涵盖视场240um x 240um，利用XY扫描获得30 x 30平铺图像，重叠区域为40um，黏贴成一幅完整图像。Z轴扫描的间隔为547nm。
(4)使用机器学习方法在明场图像进行细胞质、背景、细胞核分割(开源软件Ilastik分割细胞质和背景，预训练深度学习网络HoVerNet分割细胞核)。并将细胞核、细胞质、背景的分割掩膜直接应用到折射率图像，用于定量分析(如图1d)。
图1
折射率图像上肿瘤和正常区域的结构有差异，对来自两个病人ccRCC切片，分析其恶性区域和正常区域的折射率SD(局部标准差，local standard deviation)，最终表明恶性区域的RI SD增加。这一结论在细胞核、细胞质都一致。
图2
细胞核内(intra-nuclear)结构异质性定量分析结果
进一步分析细胞核内的结构异质性，分析了正常和恶性细胞核的均值折射率(Mean RI), CV(coefficient of variation), 高折射率占比(high-RI propotion)，表明恶性细胞核的三个指标均有增加。
图3
参考文献：Juyeon Park, Su-Jin Shin, Jeongwon Shin, Ariel J. Lee, Moosung Lee, Mahn Jae Lee, Geon Kim, Ji Eun Heo, Kwang Suk lee, and YongKeun Park, “Quantification of structural heterogeneity in H&E stained clear cell renal cell carcinoma using refractive index tomography,” Biomed. Opt. Express 14, 1071-1081 (2023)
DOI：https://doi.org/10.1364/BOE.484092
