浙江大学钱骏Small Methods：利用深度学习技术提高活体荧光显微镜的光学通量

具有高空间分辨率、高特异性、无接触与无辐射等优点的荧光显微镜对于成像精细生物结构、了解生物过程、实施疾病诊疗至关重要；然而，目前许多荧光显微镜无法实现大深度原位动态生理活动的观察。多光子荧光显微镜，特别是双光子荧光显微镜使得高散射组织内部的高空间分辨率成像达到了前所未有的深度，极大推动了生物结构与功能的研究。然而，双光子显微镜很难在不牺牲视场与扫描像素数(如~512×512像素)的情况下将成像速度提高至45帧/秒以上；高峰值功率的飞秒激光使得双光子荧光显微镜具有较大的光毒性。近年来，具有适度水吸收、低散射与低自发荧光的近红外二区(NIR-II, 900-1880 nm)作为新型生物成像窗口受到了广泛关注；值得注意的是，对于面阵探测而言，虽然NIR-II对生物组织的主要成分——水的吸收相较于可见光波段呈指数级增长，但适度吸收有利于增加弹道光比例，进而提高成像质量。NIR-II荧光宽场显微镜因具有大成像深度、高时间分辨率与低光毒性等优点得到了广泛的应用，有报道利用NIR-II荧光宽场显微镜实现了1.4 mm深度的活体小鼠脑血管成像。然而，生物组织与光学系统导致的图像退化使得NIR-II荧光宽场显微镜的空间分辨率亟待提高。

近日，浙江大学钱骏教授课题组报道了一种具有高光学通量与大成像深度的活体荧光显微镜。以深度学习技术为桥梁，结合NIR-II宽场荧光与双光子荧光技术：NIR-II荧光宽场显微图像从大量双光子荧光显微图像中学习，在不牺牲其高时间分辨率的前提下，提高了前者的空间分辨率与图像信号-背景比，从而有效提高了NIR-II荧光宽场显微镜的光学通量。

图1 高光学通量活体荧光显微镜的构建与应用。

如图1所示，研究人员通过搭建一套双模态荧光显微镜以获取同视场的双光子与NIR-II宽场荧光显微图像，作为尺度循环网络的训练数据；PSNR与SSIM等数据表明尺度循环网络显著提高了NIR-II荧光宽场显微镜的空间分辨率与信号-背景比，构建了高光学通量NIR-II活体荧光显微镜，有效解决了生物组织导致的图像模糊问题。如图2与表1所示，在高光学通量NIR-II荧光显微镜的辅助下，进行活体啮齿动物大脑血管的三维重建，实现了5倍轴向与12倍横向分辨率的提高。此外，在高光学通量NIR-II显微镜以30帧/秒的成像速度观察到了早期急性呼吸衰竭小鼠的微小脑血管扩张。本项目所构建的活体荧光显微镜具有低光毒性、高时空分辨率、大成像深度、系统便捷与成本较低等优点，为今后其在基础医学与临床诊断等领域的应用提供了一种可行度较高的方法。

图2小鼠脑血管的三维重构图像。（a）左图DE为普通NIR-II荧光宽场显微重构图，右图SRN为深度学习技术辅助的高光学通量NIR-II荧光宽场显微重构图。比例尺：50 μm。（b）596-644 μm深度三维成像的二维投影图像及其傅里叶变换图像。全视场比例尺：50 μm，放大视场比例尺：10 μm。

表1 图2b中图像空间分辨率分析。

本文通讯作者为浙江大学钱骏教授，第一作者为浙江大学博士研究生陈润泽。该项研究获得国家重点研发计划项目（2022YFB3206000）、国家自然科学基金（61975172与62035011）与中国博士后科学基金（BX20220260）的资助，谨此感谢。