用于深度无标记成像的人工共聚焦显微镜

三维细胞系统能更准确地重现体内细胞功能和细胞外基质的发育，正逐渐在疾病机制研究和药物疗法上替代二维单层细胞。如类器官和细胞球体等三维细胞结构，已经在组织工程、高通量毒理学、个性化医疗和工程多细胞生命系统等领域得到广泛应用。所有这些应用场景，都急切的需要一种能了解细胞活力和细胞簇增殖的新技术。这种技术理论上需要在细胞系统的任意深度具有亚细胞分辨率、能够在长时间尺度上获得动态信息，且完全无损(即不能影响细胞簇的活性和功能)。

由于可见光波长尺度接近亚细胞结构，因此，使用光学手段是能满足这些要求的。但是，现有的显微镜技术不适合厚样品研究。由于典型的细胞球体尺寸在数百微米至毫米量级(这要远大于光波传播的散射平均自由程)，因此，要在细胞层级分析光学混浊聚集体是很困难的。目前的高通量研究通常仅限于在低倍率下提取如球体直径这种粗略参数。

基于此，美国康奈尔大学的Xi Chen(一作兼通讯)和伊利诺伊大学香槟分校的Gabriel Popescu将激光扫描定量相位成像系统与深度学习算法结合，提出了一种人工共聚焦显微镜(artificial confocal microscopy,ACM)，能将无标记的样品渲染成合成荧光共聚焦图像。ACM能够在无标记(无损)样品上实现共聚焦级深度切片、灵敏度和化学特异性。

(1) 在商业激光扫描共聚焦系统上添加定量相位成像模组，在同一个视野同时荧光和定量相位成像；

(2) 利用相位图像和荧光图像对训练卷积神经网络，将相位图像转换成荧光图像。

(1) 系统组成。在商业激光扫描共聚焦显微镜(LSM900, Airyscan 2, Zeiss)上增加定量相位成像模组，同时能获得荧光图像和相位图像。如图1a所示，LSM、差分干涉相衬(differential interference contrast, DIC)显微镜和激光扫描梯度光干涉显微镜(laser scanning-gradient light interference microscopy, LS-GLIM)构成ACM装置。相移通过全波液晶延迟器(liquid crystal variable retarder, LCVR)完成，干涉强度图由光电倍增管(PMT, Zeiss)记录。相移增量为π/2，从0到3π/2记录4帧。完成1744×1744像素图像采集需要~3.7s。定量相位图像使用相位重建算法和希尔伯特变换算法完成。LS-GLIM的三维图像形成理论模型为：基于弱散射样品，考虑一阶玻恩近似散射下的非均匀波方程。

图1

(2)网络训练。网络架构是用EfficientNet替换标准U-Net中的编码器，构成多通道E-U-Net。用同时采集到的相位和荧光图像训练E-U-Net，网络的输入为三个相邻的相位图，输出为相应的中间荧光图像。

图2