荧光大讲堂第九讲 – 时间分辨技术及单光子计数
时间分辨技术及其发展
时间分辨技术是一类用于测量事件发生时间或时间间隔的方法，它能精确测定物质发射或吸收荧光的时间，从而揭示微观事件的动态过程。通过使用高灵敏的探测器和复杂的信号处理技术，该技术可以实现从皮秒到亚毫秒级别的高分辨率测量，广泛应用于生物医学研究、材料科学和光电子学等领域，为科学研究提供了强大的工具。
目前，脉冲激光和/或发光二极管可满足任何荧光光谱分析的需要，而具有高时间分辨率、动态范围和测量速度的检测技术一直是改进的重点。以下列表简要总结了时间分辨荧光测量技术的主要发展阶段。
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早期阶段（20世纪初至20世纪中期）：
在这个早期阶段，荧光技术主要依赖于基础的光学检测方法。研究人员使用基本的光学设备来观察和记录荧光现象。然而，这种方法无法提供高度精确的时间测量，也无法在极短的时间尺度内进行测量。
2
单光子计数技术（1950s-1960s）
在这个阶段，单光子计数技术的出现推动了时间分辨荧光技术的发展。这项技术使用了先进的探测器，例如光电倍增管，可以逐个记录光子的到达时间，从而实现了高时间分辨率的测量。这种方法使得科研人员能够在微观层面观察和研究极快速的动态过程。
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荧光相关光谱学（1970s-1980s）：
–在这个阶段，引入了荧光相关光谱学，使得研究人员可以探索多种荧光事件之间的关联。通过记录荧光信号的相关性，科学家们可以获取事件之间的时间信息，从而进一步了解微观系统的动态行为。
4
脉冲阵列技术（1980s-1990s）：
随着电子学和激光技术的快速发展，脉冲阵列技术的出现在时间分辨荧光技术中起到了革命性的作用。这种技术利用快速电子学和光学技术，将信号分割成小的时间窗口，从而实现了极高的时间分辨率。科学家们可以利用这一技术在亚皮秒级别进行测量。
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飞秒激光技术（1990s至今）：
飞秒激光技术的发展进一步推动了时间分辨荧光技术的精度和分辨率。通过利用极短的飞秒激光脉冲，研究人员可以实现飞秒甚至阿秒级别的时间分辨，使得他们可以深入研究超快速动力学过程。
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多光子时间分辨技术（2000s至今）：
最近几十年，多光子技术与时间分辨技术相结合，使得科学家们可以同时检测多种不同波长的荧光信号，拓展了技术的应用领域。
随着技术的不断发展，时间分辨荧光技术已经成为生物医学研究中不可或缺的工具，用于研究生物分子的动态过程、蛋白质折叠、细胞信号传导等等。同时，它也在材料科学、光电子学等领域有着广泛的应用。这一技术的持续进步将为科学研究提供更精确的工具和更深入的了解。
时间分辨光子计数
可以说，时间分辨光子计数是目前应用最广泛的技术。这种方法的一个基本优点是它能记录衰变曲线的真实形状（发射强度的时间演变），而无需假设特定的衰变模型。另一个优点是其固有的灵敏度。
常用的时间分辨光子计数方法：
1.飞行时间测量：
原理：这是一种基于光子在介质中传播的速度来测量光子到达时间的方法。当光子通过介质时，会以一个特定的速度传播，这个速度取决于介质的折射率等特性。通过测量光子从光源到探测器的传播时间，可以计算出光子的到达时间。
应用：飞行时间测量通常用于测量高能量粒子的到达时间，例如在粒子物理实验中。
2.交叉关联时间测量：
原理：这是一种通过比较两个或多个光信号的到达时间差异来测量光子到达时间的方法。通过将不同信号之间的时间关系进行交叉关联，可以确定光子的到达时间。
应用：交叉关联时间测量通常用于研究光子在多个探测器之间的到达时间差异，以探索光子之间的相互作用。
3.单光子计数：
原理：这是一种通过使用单光子探测器（如光电倍增管或单光子计数器）来记录单个光子的到达时间的方法。每当一个光子到达，探测器会产生一个电子信号，记录下光子的到达时间。
应用：单光子计数常用于研究低光强情况下的光子到达时间，例如在量子通信和量子密钥分发中。
4.超快激光技术：
原理：通过使用超快脉冲激光器产生极短脉冲的激发光源，与待测光子的时间尺度相匹配，从而实现高精度的时间分辨测量。
应用：超快激光技术广泛应用于光学、光子学和材料科学等领域，可用于研究极短时间尺度的光子行为。
这些方法各自有其适用的场景和优缺点，选择合适的方法取决于实验的具体要求、光子到达时间的范围以及实验条件等因素。在实际应用中，科学家和工程师们会根据需要选择最合适的时间分辨光子计数方法来进行研究和实验，而我们最为熟悉，同时也是应用最为广泛的技术就是单光子计数技术。
下图是常见的时间分辨光子计数结果，其体现的结果就是在物质吸收能量（受到激发）后的发光强度随时间的衰减曲线，那么原理上，我们只需要给物质一个激发光，然后不断记录不同时间点的荧光强度就可以了。
虽然听起来很简单，但是实际操作起来会遇到一个问题，就是对探测器的要求非常高，因为荧光材料的衰减是非常迅速的，以常见的有机荧光材料为例，其荧光寿命通常在几百皮秒到几十纳秒之间，那么要精确的测定这个时间，就要求探测器的灵敏度要在10 ps级别，这种探测速度是传统的电子方法很难实现的。
于是另外一种巧妙的方法代替了这种直接测量法，利用多次激发-检测的循环，我们可以达到相同的效果，理想的方法是一次性激发1024个光子，然后每隔一段时间测定有多少个光子回到基态（因为荧光强度与光子数成正比，所以可以直接测定荧光强度），接着以检测时间为横坐标，检测的荧光强度为纵坐标作图，就可以得出衰减曲线，而现有单光子计数的方法则是激发1024次，由于每个粒子被激发然后再回到基态并发出光子的过程是随机事件，因此其发生的时间也是随机的，因此可以通过不断测定其回到基态的时间分布来得出其衰减曲线，由于这种方法每次只记录一个光子的数据，因此也被成为时间分辨单光子技术法（Time-Correlated Single Photon Counting ，TSCPC）。这两种方法，前者检测的时间快，但是对设备的要求高，而后者牺牲了检测时间，但是对设备的要求低。
使用脉冲多次激发样品还能带来另外一个好处，就是可以尽量使用低能量的激光去激发样品，因为只用检测一个光子，所以对于样品的激发率没有要求，而理想的方法则需要尽量提高激发光的能量使得更多的光子被检测到，这就对样品提出了更高的要求，样品的漂白、光毒性、局部加热等都会对检测结果产生影响。通过从多个激发-检测周期构建直方图（以 ps-ns 或更长的时间范围测量），可获得真实衰减曲线的近似值，但是耗时会呈指数型增加，不过如果激发脉冲速率足够高（过去为千赫，现在为几十兆赫），就可以相对较快地得到衰变曲线的合理近似值（即直方图），并具有足够的信噪比。
那么基于这样的技术，整个时间分辨光子计数的理论流程如下：
1
光子的产生和探测：
首先，我们需要一个光源来产生光子，比如激光器或者其他光源。这些光子会被送到一个特殊的器件，通常是光电倍增管（PMT）或单光子计数器（SPC）等。这些器件可以将光子转化成电子信号。
2
光子到达的记录：
当一个光子到达时，光电倍增管或单光子计数器会产生一个电子信号。这个信号会被放大和处理，以确保准确记录光子的到达。
3
时间测量：
在系统中会有一个高精度的时钟和计数器。当光子到达时，时钟会记录下这一刻的时间。这就是时间分辨的关键。通过比较不同光子到达的时间，我们可以研究它们之间的时间关系。
4
数据处理和分析：
记录下来的时间信息会被传输到计算机或者数据采集系统中。在这里，我们可以对数据进行进一步的分析，比如研究光子到达的时间间隔、频率等信息。
一般所说的 “时间分辨光子计数法 “包括前面提到的时间相关单光子计数法（TCSPC）和多通道缩放法（MCS）。MCS 是另一种传统的脉冲计数方法，其原理就和前面提过的理想型的测定方法一样，但是由于探测器达不到要求，所以这种方法通常用于微秒或更长的时间尺度。
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Method |
TCSPC |
MCS |
|
Photoluminescence |
Fluorescence |
Phosphorescence |
|
Recorded Lifetimes |
ps, ns |
μs, ms, s |
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Resolution |
Higher |
Lower |
|
Repetition Rates |
Higher |
Lower |
参考：
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https://www.edinst.com/blog/what-is-multichannel-scaling-mcs/
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A practical guide to time-resolved luminescence lifetime determination using dedicated Time-Correlated Single-Photon Counting systems，HORIBA Jobin Yvon IBH Ltd, Glasgow, Scotland, UK.
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Measurement of Photoluminescence lifetimes in the μs Range
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多通道扫描技术（Multi-channel scaling ，MCS）
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