“一花一世界” ——光学超分辨显微成像
2014年诺贝尔化学奖授予了Eric Betzig,Stefan W.Hell,William E. Moerner 三位科学家，表彰他们在光学超分辨显微成像方面做出的卓越贡献。
图1:(1)Eric Betzig;(2)Stefan W. Hell;(3)William E. Moerner（图片来源：果壳网）
其中Stefan W. Hell教授是受激辐射损耗（STED）技术的发明人，Eric Betzig教授是光活化定位显微（PALM）技术的发明人，两项技术将显微成像带入了“纳米”时代。值得注意的是，超分辨显微的思想自提出到获得诺贝尔奖不超过20年的时间，可见光学超分辨显微成像的重大意义。除了STED技术和PALM技术之外，实现光学超分辨显微的方法较主流的还有SIM和STORM技术。本文主要简单介绍SIM、STED、PALM和STORM实现光学超分辨显微成像的方法。
01/一道200nm的“门槛”—光学衍射极限
光学的发展有着两个极端的方向，一个就是我们头顶上浩瀚的宇宙，在征服宇宙的进程中，我们希望能够看得更清更远；而另一个就是我们人眼所不能分辨的微观世界。在浩瀚的宇宙面前，我们人类是多么的渺小，可是在微观的世界面前，我们又何尝不是，小到在很长的一段时间跨不过一道仅有200nm左右的“门槛”。
那么这200nm的“门槛”是什么呢？
由于衍射的影响，一个理想的点光源经过光学系统所成的像不再是一个理想的点，而是一个有着一定大小的弥散斑。那么，当两个点的距离足够近时，其所成像的弥散斑就会重叠以致无法分辨。那能够分辨的最小的距离是多少呢？瑞利判据告诉我们：如果一个点光源所成的衍射图像的中央最亮处与另一个点光源所成衍射图像的第一个最暗处重合，两点恰好能够分辨：
图2：瑞利判据（图片来源：百度文库）
1873年，德国物理学家恩斯特.阿贝（Ernst Abbe）根据光的衍射理论得出了光的衍射极限公式：d=λ/(2nsinα)，其中λ为光波长，n为折射率，α为孔径角，d则为系统能够分辨的最小距离，而这一公式作为墓志铭被永远刻在了物理学家阿贝的墓碑上。
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图3：Ernst Abbe墓碑上的碑文
（图片来源：腾讯网）
阿贝衍射极限距离约为二分之一波长，可见光波长为400nm-700nm,因此传统的光学显微镜能够分辨的最小距离在200nm左右，阿贝衍射极限在100多年间一直被视为科学真理，200nm也成为了光学显微镜不可跨越的“门槛”。
当然，由阿贝衍射极限公式可知，波长越小分辨率越高，这也就促进了电子显微镜的诞生。电子显微镜由加速电压产生电子束，电压越高，电子束的波长越小，其可以达到可见光波长的1/1000，因此电子显微镜的分辨率可为光学显微镜分辨率的1000倍。可是电子显微镜存在很多缺点，如必须在真空环境中观测、不能进行活体观测、价格昂贵等等，生物学家们仍然期盼着光学显微镜能将他们带入“纳米”时代。
而很多物理学家们也在致力于跨越这道200nm的“门槛”，探究这“门槛”后那神秘的生命世界。上世纪90年代到本世纪初，一系列的光学超分辨技术问世，包括2014年诺贝尔化学奖的STED、PALM技术，还有SIM、STORM技术，下面将对这四种技术做简单的介绍。
02/结构光照明超分辨显微成像（SIM）
图4：Mats Gustafsson
（图片来源：科学网）
结构光照明显微成像简称SIM）技术由美国科学家Mats Gustafsson教授于2000年发明，SIM技术来源于莫尔条纹的启发。
莫尔条纹是两种空间频率相近的周期性结构叠加产生的光学效果，如下图所示：
图5：莫尔条纹
莫尔条纹
其实，莫尔条纹在生活中也很常见，比如隔着多层纱窗去看外面的风景，用手机拍电脑屏幕出现的条纹，纸币中用到的防伪技术等等，都有莫尔条纹的身影，我们这里先不谈。
莫尔条纹的精髓就是：两种具有高频信息的周期性结构叠加会产生低频的莫尔条纹，将不可探测的高频信号转化为可探测的低频信号，这也就是SIM的精义。在显微成像中，200nm“门槛”内的高频信息就作为其中的一种结构，而需要另一种周期性结构与之叠加使其本不可探测的高频信息转化为系统可探测的低频信息，这就需要结构光的照明。
结构光是什么呢？
Gustafsson教授曾经在接受采访时说：“我的电学背景让我对世界有一种独到的认识，我看问题喜欢从频域而不是空域，这是我成功的主要原因。”那下面就从频域来解释SIM是如何实现超分辨成像的。
被探测的图像转换到频域中，表示图像中包含的高频信息和低频信息，其中中心原点周围为低频信息，边缘处表示高频信息，如下：
图6:(a)被探测的图像;(b)转换到频域的图像
而在频域中考虑，光学系统传递函数OTF相当于一个低通滤波器，只有低频的信息可以通过而被探测，而高频信息被阻挡而不能通过，意味着图像高频信息的丢失，如下：
图7：左：光学系统（低通滤波器）；右：探测到的低频信息
想象一下，通过一个孔去看外面的风景只可以看到孔那么大的范围，如果将孔扩大，就可以看到更多事物的信息。结构光的作用就相当于拓展光学系统的OTF，使更多的高频信息可以被探测。
那结构光是如何使丢失的高频信息
能够探测的呢？
频域中，余弦条纹的傅里叶变换为三个函数分量，空域中结构光强度与被测样品强度为相乘的关系，根据卷积定理，频域中则为卷积的关系，则相当于对光学传递函数OTF在某个方向上得到位移复制，该方向与条纹方向有关，通过改变结构光的方向，就可以使OTF在各个方向上得到拓展，结果如下：
图8：拓展后的OTF
这样，相当于扩展了系统的光学传递函数OTF（看风景的孔变大），更多的高频信息能够通过被探测，实现超分辨成像。不过遗憾的是，同样是由于衍射极限的影响，SIM只能将分辨率提高两倍。之后，利用荧光分子非线性关系实现的饱和结构光照明显微成像可实现50nm的分辨率。
03/受激辐射损耗超分辨显微术（STED）
如果你有一只粗笔，如何用它画一条细线？
答案是用橡皮将周围擦去，当然就变细了。
而这就是受激辐射损耗显微成像（STED）技术的形象描述，这里的粗笔就是我们上文中提到的光学衍射极限，也是点扩散函数PSF，一定大小的点扩散函数PSF导致衍射极限内的点不能够被分辨；画一条细线即是分辨出衍射极限内的点，如果将衍射极限周围“擦去”，从而达到抑制点扩散函数的效果（“画细线”），不就实现超分辨了吗？
图9：左：衍射极限范围内的分子；右：被“擦去”的衍射极限
如上图，绿色圆表示具有一定大小的衍射极限，衍射极限内的点不能够被系统分辨，而如果将周围的点“擦去”，只保留中心很少的点，这样系统对其的成像就不受“擦去”点的干扰而能够分辨，从而实现超分辨。
生活中我们用橡皮可以轻松地擦去，可STED技术中这块神奇的“橡皮”是什么呢？
绿色箭头表示荧光分子经激发光激发电子由基态跃迁到激发态，红色箭头和黄色箭头分别表示受激辐射和自发辐射荧光。
—— STED技术的发明人Stefan W. Hell
这块神奇的“橡皮”就是STED光，其强度分布犹如一个甜甜圈doughnut的形状，如下所示，可以由螺旋相位板对激光调制而成，经STED光照射的地方荧光分子受激发射不产生荧光而被“擦去”，只保留中心很少的未被照射的部分发出荧光而被探测，实现点扩散函数PSF的抑制，从而实现超分辨。
图11：上：STED装置示意图；下：STED光作用示意图（图片来源：科学网）
04/单分子定位显微术（SMLM）
如果说STED是将衍射极限内的大部分荧光分子“擦去”，只保留衍射极限内很少的分子发出荧光，那SMLM技术则是在一开始就让衍射极限内极少的荧光分子发光。
想象一下，天上的星星聚集在一起，你不能清晰地分辨每一颗星星，而如果每次仅有分散的几颗发光，你就可以清晰地确定其位置。
SMLM？
单分子定位显微术全称single molecule localization microscopy，简称SMLM，主要包括光激活定位显微术（photo-activation localization microscopy, PALM）和随机光学重构显微术（stochastic optical reconstruction microscopy, STORM），顾名思义，单分子定位技术每次只对衍射极限内单独的荧光分子成像、定位，从而摆脱衍射极限的限制。
光激活定位显微术（PALM）和随机光学重构显微术（STORM）基本原理类似，只是所用荧光标记物的不同，PALM技术使用的是光激活荧光蛋白，STORM技术所用为荧光染料分子对。但遗憾的是，由于PALM技术的发明人Eric Betzig在1995年就提出了实现超分辨的思想，STORM技术发明人哈佛大学华裔科学家庄小威与诺奖失之交臂。
单分子定位显微术实现超分辨的原理如下：
图12：基于单分子定位的PALM/STORM超分辨原理
首先，使所有的荧光分子处于暗状态，用一束激光随机激活很少的荧光分子使其发光，一般点亮的荧光分子的距离超过衍射极限的距离，通过数据拟合对发光的荧光分子进行精确定位，再利用另一束激光将发光的荧光分子转换到暗状态，循环操作，直到所有的荧光分子都参与成像，对每次循环图像叠加得到样品的超分辨图像。
图13：PALM用于观察溶酶体跨膜蛋白，A为传统显微成像，B为PALM成像，C、D为局部放大图
图14：STORM对哺乳动物细胞微管成像，A、C为传统显微成像，B、D为STORM成像
上述几种实现光学超分辨显微的方法将我们带入了自显微镜发明以来没有看到的更加微小的世界，几种方法各有各的优点，也各有各的不足。《华严经》中说：“一花一世界，一叶一菩提”。微观世界中还有太多我们没有看到、未知的东西需要我们去探索，跨过了200nm的“门槛”，我们依旧渺小，揭秘更加微小的世界是光学超分辨显微的追求，也必将为生命科学带来更多的革命，为我们呈现一个更加精彩的微观世界。
最后以2014年诺贝尔化学奖颁奖词来作为结尾：“长期以来人们都为现有的光学显微技术感到困扰：如果观测物比可见光波长的一半（约0.2um）还小，现有的光学显微镜就不能解析了，称之为光学衍射极限。2014年诺贝尔化学奖获奖者们利用荧光分子‘标记’这些精细结构，使它们在显微镜下变得五彩缤纷、清晰可辨，使科学家们能一瞥纳米级别的微小世界。从此，显微技术从‘微米’时代跨入‘纳米’时代。”
参考文献
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