研究进展：自适应光学在超分辨荧光显微镜中的应用

超分辨荧光显微镜突破了传统荧光显微镜的分辨率限制，使得人们能够在纳米量级分辨率下观察细胞和组织样品，极大地推动了生命科学的发展。在这一技术中，仪器和样品引入的像差均会导致空间分辨率降低，进而导致成像质量恶化。

为此，人们引入了自适应光学技术，通过直接或间接的手段探测像差，再通过波前校正元件来校正像差，从而获得高质量的超分辨图像。

大连理工大学光电工程与仪器科学学院的王翔宇、陈曦、曹暾、马冬晗团队在《中国激光》发表文章，介绍了自适应光学的起源与工作原理，总结了其在超分辨荧光显微镜中的应用，并展望了其未来的发展前景。

1953年，美国科学家Babcock首次提出了自适应光学的概念，即实时测量大气湍流引起的波前像差，并通过变形镜产生光学相移，以进行实时补偿。1957年，苏联科学家Linnik首次提出了人造导星的概念，即在待观测恒星的位置发射一个约10km高度的信标，以测量大气湍流扰动。上述构想使得光学系统能够根据外界环境进行自动调整，从而保持最佳工作状态，因此被命名为“自适应光学”。

20世纪60-70年代美国军方将其应用于卫星成像与激光传输等领域，80年代末开始应用于天文观测。我国对自适应光学的研究始于20世纪80年代，21世纪以来，随着光学显微成像技术的发展，自适应光学被广泛应用于生物成像领域。

基于直接波前探测的自适应光学系统，主要包括波前探测器、波前控制器和波前校正器。先由波前探测器探测波前像差，再由波前控制器根据探测到的信息计算出相应的控制信号，最后由波前校正器将控制信号转变为波前相位变化，使波前恢复到无像差状态。波前探测器包括Shack-Hartmann传感器、四棱锥传感器、分区孔径波前传感器、剪切干涉仪等。

其中，Shack-Hartmann波前传感器由微透镜阵列和探测器组成，当入射波前为理想平面波时，探测器上得到的是一组均匀分布的光斑；当入射波前携带像差时，探测器上得到的光斑将发生偏移。

四棱锥波前传感器和分割孔径波前传感器的工作原理相似，都通过探测平面上的4个子图像来测量波前。剪切干涉仪常被用于判断光束的准直程度，还可以通过判读干涉条纹的形状来分析光束的波前分布。波前校正元件是一种可以快速改变波前相位的主动光学器件，也是自适应光学系统的核心器件，主要包括变形镜、SLM与自适应透镜等。

变形镜通过驱动器的伸缩来改变其表面形状，从而改变传输距离，实现波前校正；SLM通过改变施加在液晶像素分子上的电压，使液晶像素分子的指向矢与入射光的偏振方向产生夹角，就可以改变液晶单元的折射率，实现波前校正；自适应透镜通过对其施加电压使薄玻璃窗产生弯曲，就可以改变传输距离，实现波前校正。

基于直接波前探测的自适应光学的工作原理。（a）自适应光学系统；（b）Shack-Hartmann波前传感器工作原理；（c）四棱锥波前传感器（上）和分割孔径波前传感器（下）的工作原理；（d）剪切干涉仪的工作原理

基于间接波前探测的自适应光学系统，不需要使用波前传感器，根据显微镜采集到的图像来推断像差，并利用波前校正器予以修正。该系统通常利用变形镜、SLM等波前校正元件，输出一系列像差修正方案，采集相应的图像，选择图像亮度、锐度等作为度量标准评估图像的质量，并通过高斯拟合、二次拟合等方式，得到度量标准最优时对应的像差修正方案，就可以生成对应的波前控制信号。

其中最典型的方法是模态波前传感，即利用波前校正元件产生一系列互相正交的像差模态（通常近似于Zernike像差），对每一种模态输入不同的幅值，得到对应的图像，然后计算其度量标准，再通过拟合得到度量标准最优时对应的幅值，最后将所有模态的幅值叠加起来，得到最终的像差修正方案。

此外，也可以采用遗传算法、粒子群算法、深度学习等群智能优化算法，根据度量标准对像差修正方案进行优化迭代，提高收敛速度。

STED显微镜采用两束中心重合的激光照射样品，使艾里斑中心区域的光子自发辐射荧光，从而缩小PSF尺寸，实现超分辨成像，成像光路由激发光路、发射光路和损耗光路组成，损耗光路的像差对成像质量影响最大。

2012年，Gould等首次提出将自适应光学应用于STED显微镜，使用两个SLM分别校正激发光路和损耗光路的像差，在斑马鱼视网膜切片上方25μm深度处实现了250nm的轴向分辨率；2013年，Gould等提出利用自适应光学对准激发光路和损耗光路的方法，将对准精度提高到4.3nm±2.3nm。

2014年，Lenz等提出离轴放置SLM的方法，对自然杀伤细胞和靶细胞之间的微管蛋白在8-10μm深度处实现了横向120nm、轴向173nm的分辨率。

2016年，Patton等提出利用双自适应光学器件（变形镜与SLM）校正厚组织样本像差的方法，对完整果蝇大脑突触中的囊泡谷氨酸转运体进行了超分辨成像，成像深度达到了10μm。

2018年，Wang等提出利用遗传算法实现STED显微镜中损耗光路像差测量的方法，并通过SLM予以校正，对24μm深度处斑马鱼视网膜和100μm深度处斑马鱼胚胎切片实现了超分辨成像。

自适应光学在STED显微镜中的应用。（a）STED显微成像的原理；（b）使用两个SLM分别校正激发光路和损耗光路的像差；（c）利用自适应光学对准激发光路和损耗光路；（d）离轴放置SLM；（e）利用变形镜和SLM校正三条光路的像差（S，样品；Di，二向色镜；APD，雪崩光电二极管；Exc.，激发光；Emi.，发射光；QWP，四分之一波片；PMT，光电倍增管）

2019年，Zdankowski等提出提高损耗光路像差校正精度的方法，对15μm深度处的有丝分裂纺锤体实现了三维分辨率为 50nm×50nm×100nm的超分辨成像；2020年，Zdankowski等使用双SLM分别校正激发光路和损耗光路像差，对多巴胺神经元中的hiPSC衍生轴突在80μm深度处实现了横向204nm、轴向310nm的分辨率。

2020年，Antonello等使用多尺度小波分析来量化显微镜像差造成的分辨率损失的方法，对14μm深度处组织型海马切片中的CA1锥体神经元实现了超分辨成像。

2021年，Hao等将自适应光学与4Pi-STED技术相结合，对细胞中的微管、高尔基体、内质网、线粒体等，以及组织中的神经元突触和环状管进行了超分辨成像，三维分辨率均优于 50nm。

2021年，Velasco等将自适应光学与双光子激发、有机染料 ATTO590、长工作距离水浸物镜相结合，对164μm深度处的固定鼠脑和76μm深度处的活体鼠脑实现了超分辨成像。

使用自适应光学前后STED成像结果对比。（a）多巴胺神经元中的hiPSC衍生轴突在80μm深度处的成像结果；（b）固定鼠脑组织中的星形胶质细胞在164μm深度处的成像结果

在4Pi-STED显微镜中应用自适应光学。S，样品；Di，二向色镜；APD，雪崩光电二极管；Exc.，激发光；Emi.，发射光；RM/GM，振镜

SIM显微镜采用点阵、条纹等周期性结构光场照明样品，解析出普通显微镜无法获得的高频信息，在所有方向上将分辨率提升两倍，实现超分辨成像，成像光路由激发光路和发射光路组成，两路的像差均需要通过自适应光学进行校正。

2008年，Débarre等首次将自适应光学应用于SIM，在不使用波前传感器的条件下实现了像差校正，对小鼠肠道和花粉实现了更高对比度、更少背景噪声的SIM成像。

自适应光学在SIM显微镜中的应用。（a）SIM成像原理；（b）在OS-SIM中应用自适应光学；（c）将SIM与直接波前探测相结合。S，样品；Di，二向色镜；PH，针孔；PBS，偏振分光镜；RM，旋转镜

2015年，Thomas等将自适应光学与SIM结合，对固定在秀丽隐杆线虫下的100nm荧光微珠实现了超分辨成像，在 20μm×35μm的大视场上实现了140nm的分辨率，将信噪比提升了60%。

2021年，Zheng等提出了一种基于深度学习的自适应光学校正方法，并将其用于SIM，对BHK细胞中鬼笔环肽标记的肌动蛋白实现了超分辨成像。

2019年，Turcotte等将自适应光学应用于动态超分辨SIM成像，对活幼体斑马鱼和小鼠的大脑实现了帧率为9.3frame/s、分辨率为190nm的高速成像。

使用自适应光学前后SIM成像结果对比。（a）幼体斑马鱼大脑中神经突触在100μm深度处的成像结果；（b）小鼠大脑在21~29μm深度处的体内结构成像结果

2020年，Li等将自适应光学应用于光学层析结构光照明显微镜（OS-SIM），对21-29μm深度处的小鼠皮层神经元、10-110μm深度处的幼体斑马鱼运动神经元结构实现了快速超分辨成像。

2021年，Lin等将自适应光学应用于SIM，通过直接波前探测的方式校正像差，对秀丽隐杆线虫进行了超分辨成像，将波前振幅峰谷值从1.5μm降低到0.1μm。

SMLM显微镜将荧光团随机激活，获得稀疏分布的PSF，对其定位获得荧光团的精确位置，再重建出超分辨图像，发射光路的像差会导致PSF扭曲，定位精度恶化，需要利用自适应光学进行校正。

自适应光学在SMLM显微镜中的应用。（a）SMLM成像原理；（b）利用自适应光学校正仪器像差；（c）利用模态传感技术校正像差；（d）利用遗传算法校正像差；（e）利用粒子群优化算法校正像差；（f） REALM的工作原理；（g）DL-AO的工作原理；（h）CLASS光路。S，样品；Di，二向色镜；FM，翻转镜；GM，振镜；BS，分光镜；DG，衍射光栅；PBS，偏振分光镜；Exc.，激发光；Act.，激活光；Emi.，发射光

2012年，Izeddin等提出利用自适应光学消除SMLM仪器自身像差的方法，在800nm深度处分别实现了对荧光蛋白40nm的轴向定位精度和对荧光染料20nm的轴向定位精度。

2015年，Burke等采用模态波前传感技术消除了样品引入的像差，对6μm深度处的微管实现了横向78nm、轴向136nm的分辨率；2015年，Tehrani等将与强度无关的傅里叶谱和遗传算法结合起来优化像差，在50μm深度下将定位精度提高了4倍。

2017年，Tehrani等提出了通过粒子群优化算法（PSO）与傅里叶谱度量相结合来实时校正波前像差的方法，对100μm深度处的果蝇中枢神经系统实现了146nm的分辨率。

2018年，Mlodzianoski等提出了自适应像散（AA）方法，对 95μm深度处的线粒体实现了横向20nm、轴向50nm的分辨率，并重建出了患有阿尔茨海默病的小鼠脑片在24μm深度处的β-淀粉样蛋白的结构。

2021年，Siemons等提出了鲁棒有效自适应光学定位显微（REALM），对50μm深度处的微管和神经轴突进行了成像，将定位数量增加了6倍，分辨率提高了35%，实现了76nm的FRC分辨率。

2023年，Zhang等提出了深度学习驱动自适应光学（DL-AO）方法，对133μm深度处的线粒体结构和小鼠初级视皮层神经实现了横向14-31nm、轴向41-81nm的分辨率。

2023年，Park等提出了闭环积累单散射（CLASS）并将其应用于SMLM，对幼体斑马鱼102μm深度处的组织结构实现了超分辨成像，定位精度从无自适应光学时的67nm提升至34nm，可改善的像差的均方根波前畸变为2.13-3.08rad，相比REALM方法提高了2-3倍。

使用自适应光学前后SMLM成像结果对比。（a）50μm深度处微管的成像结果；（b）133μm深度处线粒体的成像结果

总之，像差对STED、SIM与SMLM等三种超分辨荧光显微镜均有影响，都需要通过自适应光学进行校正。目前，超分辨显微镜所用到的自适应光学技术以间接波前探测为主，虽然成本低，但响应速度慢、测量范围有限。

近年来，直接波前探测技术也逐渐应用于超分辨荧光显微镜，其测量速度快、精度高、范围大。

未来，自适应光学在超分辨荧光显微镜中的发展前景包括视场扩展、速度提升、深度增大，有望成为超分辨荧光显微镜的必备技术。

内容来源：

王翔宇,陈曦,曹暾,马冬晗.自适应光学在超分辨荧光显微镜中的应用[J].中国激光, 2024,51(3):0307104.Xiangyu Wang,Xi Chen,Tun Cao,Donghan Ma. Application of Adaptive Optics in Super‑Resolution Fluorescence Microscopy[J].Chinese Journal of Lasers,2024,51(3):0307104.