Photonics Research 2021年第6期Editors’ Pick：
Congping Chen, Zhongya Qin, Sicong He, Shaojun Liu, Shun-Fat Lau, Wanjie Wu, Dan Zhu, Nancy Y. Ip, Jianan Y. Qu. High-resolution two-photon transcranial imaging of brain using direct wavefront sensing[J]. Photonics Research, 2021, 9(6): 06001144
双光子激发荧光显微镜(TPM)可以通过非侵入性或者低侵入性方式提供关于活体生物样品的具有多维度的结构和功能信息。因此，在近几十年TPM已成为用于小型啮齿动物活体脑成像研究不可或缺的工具。
目前，为小鼠大脑成像提供光学窗口的主要手段是开颅以及薄颅窗口。通过移除部分颅骨的开颅窗口具有侵入性，必定会引发神经胶质细胞介导的炎症反应并扰乱神经元的生理机能。将颅骨磨薄至一定厚度（~50 µm）则可以在有效减少光学散射的同时保持头骨结构的完整性，以避免脑外伤和炎症反应。
由于薄颅窗口本身存在光学异质性，其引入的光学像差最终极大限制了TPM用于活体经颅脑成像的分辨率和成像深度方面的性能。
自适应光学 (AO) 是一种最初用于天文望远镜的光学技术，最近被用于通过矫正光学系统或生物样本引入的像差来改善双光子显微成像。基于直接波前测量的AO技术一般采用 Shack-Hartman 波前传感器 (SHWS) 通过生物样本内的双光子激发荧光或所谓的“导星”来测量波前失真。
直接波前测量具有快速、稳健且光利用率高等优点，但由于其依赖于准弹道光子来确定像差，因此受样品散射限制，其准确率会随成像深度变大而迅速下降。到目前为止，通过薄颅窗口实现高分辨率以及大深度的活体脑成像仍然十分具有挑战性。
香港科技大学电子与计算机工程系瞿佳男教授课题组开发了一种基于直接波前测量的新型自适应光学双光子显微技术，可以实现对小鼠深层皮质进行具有亚细胞级高分辨率的经颅活体脑成像。相关成果发表于Photonics Research 2021年第6期。
此项工作创新性地通过对TPM的光学系统进行优化设计和对波前传感算法进行改进，从而极大提高了在散射严重条件下对相差测量的准确性，并且能够有效矫正颅骨和脑组织引起的像差。
简而言之，通过优化用于荧光激发和波前传感的数值孔径 (NA)，不仅可以增强双光子激发的荧光信号，更重要的是可以将有效NA对应孔径之外的SHWS上的坏点去除。此外，改进的波前重建算法基于对“导星”进行三维采集平均以及对SHWS图像进行空间滤波，有效地降低了由组织微观结构高度不均匀引起的SHWS上斑点的不对称性，从而极大改善了波前传感的准确性。
通过这些技术创新，该团队首次实现了对深脑皮层的锥体神经元进行亚细胞级高分辨率的经颅活体成像，成像深度扩展至脑下700 µm，如图 1 所示。通过AO矫正生物样本引入的相差，该成像技术可以清晰分辨微小的神经元结构，例如树突棘。而如果没有AO校正，则完全无法识别这些结构。
图1 AO 能够实现对小鼠深脑皮层进行亚细胞级分辨率的经颅活体脑成像（神经元（橙色）和微血管系统（红色）是通过 50 µm 厚的薄颅骨窗口成像得到）
另外，凭借 AO矫正提供的理想的点扩展函数（PSF），该研究还实现了对单个树突或树突棘进行微米级高精度激光手术，这可用于研究神经元在被损伤后其与小胶质细胞的相互作用。
本文通讯作者瞿佳南教授认为：“这项技术为活体脑研究提供了一个低侵入性、高分辨率的成像机会。因此，这是一个令人兴奋的进展，具有促进神经科学研究的巨大潜力，尤其是针对免疫相关研究。”
在大脑深处区域的成像分辨率和对比度仍然受到颅骨和脑组织引起的严重散射的限制。在这种情况下，更长的激发/发射波长甚至三光子吸收过程是更佳的选择。
该团队在未来将专注于进一步提高成像深度和分辨率，通过将该直接波前测量的AO技术与近红外荧光标记和三光子激发相结合，以实现对薄颅骨窗口甚至完整的颅骨窗口进行高分辨率活体脑成像。
香港科技大学
主要研究方向：非线性光学成像、神经光子学
陈聪平，香港科技大学电子与计算机工程学系博士研究生。2015年于华中科技大学光信息科学与技术系获学士学位。博士期间研究工作发表于Science Advances, ACS Chemical Neuroscience, Cell Reports等多个期刊。
香港科技大学
主要研究方向：非线性光学成像、自适应光学
秦仲亚，香港科技大学电子与计算机工程学系博士研究生。2016年于浙江大学光电信息工程系获学士学位。博士期间研究工作发表于Science Advances，Light: Science & Applications，Biomedical Optics Express等多个期刊。
香港科技大学
主要研究方向：生物光子学、生物医学科学仪器、光学成像
瞿佳男，香港科技大学电子与计算机工程学系教授。1990年于中国科学院上海光学精密机械研究所获博士学位；1991-1994年先后在美国加州大学尔湾分校（UC Irvine）和加拿大BC Cancer Research Centre从事博士后工作；1995-1997年在加拿大Ontario Cancer Institute担任研究员；1997年至今加入香港科技大学电子与计算机工程系。分别于2012和2014年当选美国光学学会会士（OSA fellow）和国际光学工程学会会士（SPIE fellow）。曾担任Optics Letter, Journal of Biomedical Optics, International Journal of Optics等期刊编辑。
