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斜面结构照明让光片显微镜分辨率翻倍

斜面结构照明让光片显微镜分辨率翻倍

技术背景：
对于荧光显微镜，我们必须在时空分辨率、成像深度以及光漂白和光毒性发作前成像的持续时间之间做谨慎的平衡。例如，虽然超分辨显微镜让成像系统的空间分辨率超过了衍射极限，但是通常需要薄样品、更高激光功率和多帧图像采集。因此，光毒性和低时间分辨率问题就凸显出来。光片显微镜采取独特的成像结构，降低样品的照明负担，提高成像速度的同时减小光毒性，分辨率受衍射极限约束。
结构光照明可以让荧光显微镜的分辨率翻倍，其时间分辨率高，在激光功率从低到高的范围内适用于任何荧光基团。将结构光照明和光片显微镜结合理论上可行，但是实际实施非常棘手。结构光照明需要序列照明具有不同相位和朝向的正弦干涉图案。光片显微镜通常将照明和检测物镜分离，现有的光片显微镜结构不能在实现多个朝向结构光图案和样品便于放置之间取得平衡。如，晶格光片显微镜虽然可以出射结构光照明，但是分辨率不均匀。而增加结构光朝向需要增加照明物镜数量，导致留给样品放置的空间极小，玻璃盖玻片会阻挡光路。
文章创新点：
基于此，美国德克萨斯大学西南医学中心的Bingying Chen(一作)和Reto P. Fiolka(通讯)等人提出一种斜平面结构光照明光片显微镜(oblique plane structured illumination microscopy, OPSIM)，获得了小于150nm的各向同性横向分辨率，相比传统的结构光照明显微镜具有更低的光毒性，体积采集速度超过1Hz。
原理解析：
系统在斜平面光片显微镜基础上添加图像旋转模块、迈克尔逊干涉仪照明模块组成，最终实现照明和采集使用同一个物镜，照明光为结构光，且能有三个朝向，实现近似各向同性分辨率，且分辨率提升2倍的效果。图1为斜平面结构光照明光片显微镜工作原理。图1a实线圆表示普通显微镜观测到的空间频率分量，虚线圆表示一维结构光(黑白线条结构)照明引入移频，频率混叠后扩大了频谱空间，使得分辨率获得提升。三个不同朝向的照明模式，可以获得近似各向同性分辨率的提升(系统详细结构示意图见附录)。图像重建如图1h,首先对每个朝向下采集的图片进行去倾斜、旋转、配准等预处理，然后使用结构光照明显微镜重建手段进行重建。

 

图1

实验结果：

使用OPSIM对细胞样本进行成像，模糊图像为未使用结构光照明斜平面显微镜采集图像。

斜面结构照明让光片显微镜分辨率翻倍

图2

附录：

系统图

斜面结构照明让光片显微镜分辨率翻倍
预处理流程1

斜面结构照明让光片显微镜分辨率翻倍

预处理流程2

斜面结构照明让光片显微镜分辨率翻倍

参考文献：Chen, B., Chang, BJ., Roudot, P. et al. Resolution doubling in light-sheet microscopy via oblique plane structured illumination. Nat Methods (2022). 
DOI：https://doi.org/10.1038/s41592-022-01635-8

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