相位相关光谱：无标记全息方法测量流动生物微粒

定量检测流动中的微粒（例如血管中流动的血细胞、沿着细胞内微管主动运输的囊泡）对于研究许多生命过程十分重要。人们提出了多种技术以测量流场中的微粒：包括粒子图像测速（PIV）、多普勒光学相干断层成像（DOCT）和荧光相关光谱(FCS)。PIV技术通过对粒子进行连续拍摄，以分析相邻两幅图像中粒子的平均位移来确定液体的流速和粒子的直径，该方法仅适用于稀疏的示踪粒子。DOCT利用低相干干涉和多普勒频移分析来检测组织深处血管内的血流情况，但是无法获得细胞的密度信息。

FCS，尤其是近年来提出的双焦点FCS，是检测流场中微粒的一个重要方法。在双焦点FCS中，当含有荧光标记微粒的液体流经两个焦点时，记录两个焦点内荧光信号；通过对两个焦点内荧光信号做自相关和互相关计算，可以实现对微粒流速和密度的测量。然而，传统的FCS和双焦点FCS都需对样品进行荧光标记。荧光标记则会对细胞活性产生较大影响，同时其光漂白和光毒性阻碍了对活体样品的长时间检测。

折射率是与材料介电常数相关的固有光学参数，复杂样品（如细胞）的折射率分布与其化学成分分布密切相关。研究发现，细胞内几乎所有亚细胞器的折射率均不同于细胞质的折射率，生物微粒（如血细胞等）的折射率也不同于其周围的液体背景。因此，利用定量相位成像可以高衬度地获得这些亚细胞器及生物微粒的图像。当我们利用相位衬度代替荧光衬度时，就可以通过传统双焦点FCS的方法在天然状态下获得流场中微粒动力学信息。

基于以上思路，西安电子科技大学郜鹏教授课题组和德国KIT的G. Ulrich Nienhaus教授课题组提出并验证了用于流动中的微粒检测的双光束相位相关光谱方法（2B-ФCS）。在2B-ФCS中，利用数字全息显微（也可以是其他定量相位显微方法）对连续流动的微粒进行定量相位成像。之后，通过对相位图像序列中两个相邻圆域内随时间变化的相位曲线进行自相关和互相关分析，在无需标记的前提下获得了微粒的流速、直径、浓度等信息。文中，作者利用2B-ФCS实现了大鼠血细胞密度的体外测量和斑马鱼血液流速的在体测量。相关研究成果发表于Photonics Research 2023年第5期。

图1 双光束相位相关光谱(2B-ФCS)原理。(a)利用数字全息显微系统连续采集流场中微粒的相位图像序列；(b-d)提取相位图像序列中两个圆形观察区域内随时间变化的相位信号;(e)根据两个相位轨迹计算的自相关和互相关曲线

2B-ФCS定量检测微粒浓度和流速的步骤：首先，通过数字全息显微系统连续采集流动微粒的相位图像序列，然后对图像序列中两个选定圆形区域的相位扰动进行相关计算，最后使用物理模型拟合相关曲线来获取微粒的浓度和流速（如图1所示）。作者通过利用强度图像序列和相位图像序列，来进行相关分析的优劣比较，证明了利用相位图像序列可以显著提高自/互相关的幅度和信噪比。

应用1：使用2B-ФCS对大鼠血细胞的密度进行体外测量。结合微流控通道，对稀释100倍的大鼠血液进行测量。280组测量结果的分布直方图显示大鼠的血细胞密度为4.7 ± 1.9×10⁶µL^–1 (平均值±标准差)、血细胞平均直径为4.6 ± 0.4 µm (平均值±标准差)，如图2所示。

图2 2B-ФCS对大鼠血细胞密度与直径的测量。(a) 测量流程图；(b)流动血细胞在六个不同时刻的相位图像；(c,d)血细胞密度和直径的测量结果直方图

应用2：利用2B-ФCS对斑马鱼胚胎血管内血流进行了动态测量。利用DHM连续记录了斑马鱼的静脉和动脉血管的6000帧全息图。从DHM的全息图中可以再现出血管的相位图像，在相位图像序列中分别选取两个圆形区域以覆盖斑马鱼的动脉和静脉血管。之后，对两个圆域内的相位-时间曲线进行相关分析，可以获得动脉和静脉中血细胞的流速。通过对15条斑马鱼进行测量，统计得到动脉和静脉的血液流速分别为290 ± 110 μm s^–1 和120 ± 50 μm s^–1，如图3所示。

图3 2B-ФCS对斑马鱼胚胎血液流速的体内测量。(a)使用DHM装置采集斑马鱼胚胎的血管部位相位图像；(b)从血管图像中提取的两个相位-时间轨迹计算出的自相关和互相关曲线；(c)动脉和静脉的血液流速统计图

研究团队表示：“2B-ФCS利用微粒相位与其周围介质在折射率上的差异来提供衬度，可以在无需额外荧光标记的前提下，结合相关分析实现对微粒流速、直径、浓度等信息的高精度测量。尤其是，当该技术与深度学习相结合时，可以对不同尺度的微粒进行同时测量。未来，该技术有望在血液检测和水质检测中得到普遍应用。”

西安电子科技大学先进光学显微与光谱技术团队

西安电子科技大学-先进光学显微与光谱技术团队旨在研究先进光学显微与光谱技术，由8名教职工和18名博硕研究生组成。实验室学术带头人郜鹏教授为德国“洪堡学者”、欧盟“玛丽居里学者”、国家级青年人才，Optics & Laser Technology和Frontiers in Physics期刊副编辑。团队依托复杂环境光电感知教育部重点实验室和信息纳米材料陕西省高校工程研究中心，研究方向包括但不局限于：超分辨光学显微、定量相位显微、显微光谱技术。迄今在Nature Photonics、Adv. Opt. Photon.等学术期刊发表研究论文100余篇，授权发明专利10项（产业转化4项），撰写《数字全息显微》学术专著1部。研究工作曾被选为期刊封面、美国光学学会-研究热点、并被ScienceDaily, Physics News等海外媒体所报道。

编辑 | 木拉提·满苏尔

3、Xuqing Sun, Hongyao Liu, Liwen Jiang, Ruxue Wei, Chang Wang, Xue Wang, Xiaojuan Sun, Fei Wang, Xinchao Lu, Andrey B. Evlyukhin, Chengjun Huang. Directional surface plasmon polariton scattering by single low-index dielectric nanoparticles: simulation and experiment[J]. Photonics Research, 2023, 11(5): 765