李小龙等 光行天下 2022-05-29 23:10 Posted on 四川
摘要：微流控技术作为建立微型分析平台的关键技术，从20世纪90年代发展至今不仅逐渐具备了功能化、集成化以及微型化的特点，而且与光学、微生物学、流体物理等研究领域实现了交叉融合。近年来更是涌现了诸多新型微型化芯片应用领域，其中结合光学系统的微流体分析平台得到了极其广泛的关注。结合微流控技术的概念简要阐明了微流控技术结合光学检测分析的多种前沿科研领域，如微流控光学器件、微流控生物免疫荧光检测以及微流控在光学检测方法中的应用，并对未来的发展方向进行展望。
随着微机电技术的高速发展，掀起了微型化制造业的浪潮，多种以微型化、高灵敏性、智能化为特点的新技术应运而生，微流控芯片技术正是诞生于该背景下的技术。近年来，微流控芯片技术以其微型化、低成本、高灵敏度的特点，正逐渐成为当前前沿分析领域中的研究热点。研究者通过将复杂的外界流体迁移过程集成到尺度仅为几微米到几百微米的微型腔室内，利用电化学反应、静电力驱动、气压力控制等多种微流体操控技术来实现管道内部流体的精准控制。目前，该技术已广泛应用于生物化学分析、流体控制、微流控光学芯片等多种场合中。
近年来，光学分析检测系统以其集成化、高精度、高灵敏度的特点广泛应用于物质检测分析场合，但传统光学分析仪器存在体积庞大、价格昂贵、可调性差等诸多缺陷，并不能满足当前微型集成化的要求，成为了阻碍现代微型化光学系统进一步前进的壁垒。在该背景基础下，研究人员开始将微流控的概念应用于微型化光开关上，从此开启了光学系统微型化研究的新篇章。随着对微流控光学系统研究的不断深入，微流体芯片技术与光学系统两者在检测分析、加工制造、免疫荧光分析等多领域进一步加深了联接，在科技高速发展的今天，相信未来微流控技术还将在光学系统中开辟出一个新的研究思路。本文对近年来微流控技术在光学系统中的前沿研究领域进行综述，主要阐述微流控光学器件的制造、荧光微流控生物分析以及光学检测方法与微流控的结合等三个方面的代表性应用领域。
可变焦透镜是光学系统中常见的一类光学器件，常用于显微镜、光学刻蚀、生物检测等诸多仪器中。基于微流控芯片概念的可变焦微透镜相较于传统工艺加工的透镜，具有制程工艺简单、控制精度高、光学质量好等特点，目前微流控可变焦透镜根据其制造原理的不同主要分为两类：介质上电润湿（EWOD）可变焦光透镜以及压控流体原理的可变焦光透镜。
基于EWOD原理加工的微流控可变焦光学液滴透镜，其原理是通过在平行平面改变介质电势值，从而实现液体透镜焦距的变化。Kwon等[8]在研究EWOD原理基础上开发了EWOD可变焦光学微透镜的原型，如图1所示，该透镜主体结构是由1 μL的小液滴以及表面为疏水层材料的电极构成。当下表面电极的电势值为零即静态工作点时，小液滴表面截面形状呈现拱形；当改变电势值时，液滴下表面疏水角随即改变，在外加电势作用下，该液滴透镜的最大焦距为原始值的1.3倍，并且响应时间仅为100 ms。该液滴接触角与外加电压的函数关系为
$ {\rm{cos}}\;{\theta }_{v}={\rm{cos}}\;{\theta }_{0}+\frac{1}{2}\frac{1}{{r}_{\rm{lv}}}c{v}^{2} $ (1)
式中：$ v $ 为电极电压；${r}_{\rm{lv}}$ 为液体与固体的表面张力系数；c为电极介电层的单位面积电容：$ {\theta }_{v} $ 为液滴下表面三相接触角；$ {\theta }_{0} $ 为初始下表面接触角。
基于EWOD原理微流控液滴透镜因其结构简单、可控性强、光学性能稳定，目前在液体微流体芯片领域得到了较为广泛的应用。但是，液体微透镜工作条件所需的驱动电压仍需要达百伏以上的较高值，目前科研工作者正着眼于降低液滴微透镜所需的驱动电压值，有关这方面的研究必然会成为新的热点。
目前，基于压控流体原理的光透镜也得到了广泛的关注，研究人员提出了一种基于流体压力可调原理的微透镜制造策略。该可调微透镜主体部分由可调节液体填充透镜以及固定透镜两部分组成，系统折射率不仅可以通过改变填充腔内流体的折射率来实现，而且还可以通过改变外加气压进而改变透镜的焦距。在圆形聚二甲基硅氧烷（PDMS）弹性腔室内加载具有某种折射率的液体，通过外加气压改变腔室膜的形状，以构成透镜的凹凸性。当外加气压大于大气压强时，透镜呈现拱形；当气压小于大气压强时，透镜呈现弯月形。该微流体透镜借助气压取代了EWOD微透镜制造步骤中施加的高电势值，不仅操作简单高效、而且重复性强，具有广泛的应用前景。
在光纤网络中，光开关作为光线传播中的中间枢纽起着重要的作用。目前，应用微流体的光开关技术原理均基于内部全反射原理，主要有喷墨气泡光开关和热毛细管光开关两类，其中前者目前已经实现了商业化的应用。
内部全反射光开关原理如图2所示：在波导交叉处刻蚀一条微型通道，并向其中加载波导率相匹配的液体，当两者波导率保持一致时，光线可以径直传播，光开关保持“通”的状态，而当两者波导率不同或是波导交叉处为气泡时，光线在交叉处发生菲涅耳全反射，光线将会从另一输出端输出，光开关保持“关”的状态。
喷墨气泡光开关的原理：与上述过程类似，通过喷墨打印技术在波导交叉处进行定点实时加热液体，进而迫使液体温度达到其沸点，产生气泡，并且将气泡始终保持在交叉点处，实现对光信号通路的控制。
商业化喷墨气泡光开关技术发展较为成熟，其交换速度已达到毫秒级别，具备低偏振敏感性、低串扰等多种优异性能。但是，如何在“关”状态下良好地监测并固定气泡所在位置，仍需要进行不断地探索研究。而热毛细管光开关与喷墨气泡光开关在原理上的区别是，将折射率不同的液体通过流体驱动控制在交叉点处，因此具有更强的抗干扰性能。另外，因其具有便于集成化的结构特点，未来可能在大规模光开关阵列中得到较为广泛的应用。
激光器是光学系统中的光源发生装置，而集成化微流控激光发生装置因其低成本、多样化的特点成为了光学微流体芯片搭建的研究热点。目前，国内外多个课题组正借助不同微流体材料以及芯片结构搭建输出稳定波长的激光器。Li等[13]构建了一套基于微流控芯片技术的可调谐分布反馈型芯片染料激光器平台，研制了管道截面面积仅为10 μm2且基质材料为PDMS的微通道芯片，如图3所示。在管道入口处加载具有高折射率的罗丹明6 G染料液，微流体通道与管道外PDMS腔室两者集成化形成激光光路通路，同时在流体通道中设计了长度仅为4 mm的纵向周期排列的长方体结构，其功能类似于光栅，在长方体柱上方设置532 nm的脉冲激光器作为抽运光。该研究结果表明，通过加载不同的染料可在输出端口实现单模激光输出，并且该微型化激光器的波长可在±60 nm的范围内调节。
基于微流体技术与光学系统结合而产生的微流体光学器件为现代化光学系统的微型化、集成化提供了新的思路。该类器件具有微型化、高性能、低成本、高精度等特点，未来可以作为微型光学器件应用于光纤通信、光学显微镜、显示器技术、全光网络以及光学检测仪器中。目前微流控光学器件的发展仍处于起步阶段，仍面临着许多挑战，如检测器件的精度、流体器件的长期保存、微电子加工手段的兼容性等，但是，随着微流控光学器件研究的深入，基于微流体技术的光学器件势必会得到更加广泛的应用。
蛋白质免疫分析建立在抗原抗体之间的特异性反应，常规的免疫分析包括直接竞争、间接竞争、夹心法三种类型。其测试原理均基于加载在固相载体的抗原或抗体与样品中的反应物发生特异性吸附，进而达到捕获目标物的功能，然后通过与标准品的线性相关曲线对比即可得到待测目标蛋白含量的动态信息。该原理也被广泛应用于微流控蛋白检测领域。Deng等通过微流控芯片产生携带T细胞的微液滴，然后再通过免疫捕获微球以及荧光二抗测定蛋白的含量，如图4所示。另外，免疫捕获微球与荧光标记的二抗也可以借助磁力或设计微流控筛选结构直接固定在微流控管道内，通过检测捕获的微球表面的荧光，得到样品中目标蛋白的含量。目前基于微流控技术并且结合免疫捕获微球而设计的微流控免疫荧光检测平台已得到了广泛的应用。
图4.基于液滴的微流控方法检测分泌性细胞因子的工作流程
构建细胞体外培养体系是目前科研工作者从细胞层面了解生命科学现象的一种最为直观的方式，目前微流控芯片已经被广泛地应用于体外2D和3D细胞的培养。
微流控2D细胞的培养，在原理上与传统体外培养方式类似，首先需要对芯片内表面进行改性，改变其亲水性和极性，促使细胞能够贴壁生长。目前，最常用的修饰物质包括多聚赖氨酸（Poly-L-lysine，PLL）、胶原蛋白等，由于PLL物质是一种多聚阳离子化合物，而细胞膜表面呈负电位，通过芯片管道的修饰以满足正负电荷相互吸引的条件从而使得细胞能够实现贴壁生长。Gao等利用0.1% PLL溶液对细胞培养室的玻璃表面进行修饰，实现了A549细胞在该环境的生长，并通过细胞培养腔室、固相微萃取单元以及电喷雾电离飞行时间质谱（ESIQ-TOF-MS）三者的联用，实现了在线监测A549细胞对维生素E代谢过程的研究。
由于2D培养细胞方式局限于在平面内定义细胞的功能，并不能真实地还原体内细胞代谢分化的情况，因此3D培养细胞的方式成为了目前科研工作者的研究焦点。细胞体外3D培养方式首先需要在微流体腔室内构建适宜细胞生存的细胞外基质，最常用的材料如基质胶（Matrigel）、胶原蛋白（Collagen）和水凝胶（Hydrogel）等，在体外材料的作用下细胞可以很好地实现三维生长的方式。Wu等通过琼脂糖凝胶的作用成功在体外构建出一个模拟血管和组织间扩散过程的三维培养微流控芯片，证明了细胞自噬是致使细胞量子点毒性的原因之一。除此以外，水凝胶也得到了广泛的应用，Toh等通过在微流控芯片上集成微柱结构实现了芯片上的3D细胞培养，并成功保持了肝细胞正常的解毒功能，如图5所示。
图5.模拟药物筛选的3D微流控肝细胞芯片原理结构及实物图
随着微流控芯片技术在生物免疫荧光检测技术中的广泛应用，科研人员对细胞及其他生物分子的分析实现了微升级甚至是更小级别的检测，这对微流控高通量检测有着重要的意义，同时通过微流控生物芯片的发展也进一步促进了生物微纳系统的建立。目前，基于微流控系统对生物分子的荧光分析仅局限于对短期、静态、宏观水平的生物分子进行表征，而对细胞蛋白分子的实时动态定量荧光检测仍面临着很大的挑战，因此发展微流控技术在生物荧光检测领域的应用是极其必要的。未来在微流体芯片结构中通过集成小型二极管激光器、信号光纤、LED或是其他微型光学器件，可以使微流控生物芯片实现同步检测生物分子的功能。
拉曼光谱可以表征物质分子的振动、转动、结构特征等光谱指纹信息，相较于其他光谱检测手段，如近红外光谱、荧光光谱、X射线光谱等分析法，拉曼光谱具备更优异的灵敏度以及分辨率。拉曼光谱法可以通过不同结构分子表达的拉曼位移与强度信息，对物质的含量以及类别进行半定量表示，对极性和非极性分子均具备较高的探测灵敏度，目前被广泛应用于固液相物质的分析检测。
基于微流控芯片的拉曼检测技术适用于对微量无标记样本进行结构、性质、含量等基本信息的定性表达，通过结合纳米探针、染料标记等技术作为微量目标物的分析平台。Castano等将微流控芯片、光学镊子、拉曼检测三者集成后用于实时检测单个红细胞的血红蛋白氧分子转化过程，通过光学镊子将单个红细胞束缚在微流体管道内，通过拉曼共振光谱实时检测，使得细胞内氧合作用与光谱信号之间实现同步变化，为科研工作者对细胞微量分泌物的检测提供了新的思路。黄超等对红细胞进行检测并与传统检测方法进行对比，结构流程如图6所示，证明了通过拉曼光谱检测得到的正常与异常红细胞之间的信号差异性更大，检测灵敏性更高。
图6.结合光镊子的拉曼光谱仪装置结构示意图
物质折射率是衡量电磁波在物质内传播速度快慢的物理量，其定义为电磁波在真空以及某种介质中传播速度的比值。基于微流控技术结合折射率检测方法在生物医学检测中应用较为广泛，通过折射率检测手段进行样品物理性质表征，适用于某些无法利用荧光光谱检测的分析物，如蔗糖、聚乙二醇（PEG）等无荧光特性的物质。
细胞折射率作为细胞自身的物理属性，不同细胞的折射率随着细胞体积的大小以及表面蛋白的多样性而存在差异。另外细胞折射率也与细胞所处的微环境密切相关，根据细胞折射率属性的变化可以实时检测细胞当前的生理状态。Shao等通过比较不同细胞之间折射率的不同，实现了对红细胞、白细胞、酵母细胞三种不同种类细胞的鉴别。Liu团队建立了一套小型折射率微流控检测系统，该研究中通过光纤使得激光聚焦目标物定位在单个细胞表面，从而实现单个细胞的折射率检测。该芯片系统实现了布拉格光栅、细胞微环境调节、液滴分离三种功能的集成化，不仅实现了活细胞无损在线折射率检测，同时也避免外界不确定因素致使细胞生理性状改变而引起的折射率检测数值的变化，检测芯片结构如图7所示。
微流控光学系统检测方法在生物分析、化学成分定量、流体分析等领域有着十分广泛的应用，通过集成化的微流控系统结合光学镊子、纳米技术等技术手段，使得检测过程能够更加简便快速，未来可以集成其他检测技术进一步提升检测分辨率以及信号范围。另一方面，微流控光学检测也可以向着微型化的方向发展，通过将光源、检测模块、分析单元的小型化，进而实现微流控芯片检测系统体积的进一步减小，未来作为一种芯片实验室平台应用于在线、实时分析。
近年来，通过与生物科学、流体物理、光学工程等多学科交叉融合，微流控技术在诸多光学应用领域中发挥了不可替代的作用。微流体技术具备高效、简易、低成本的特点，将宏观的生物反应、加工制造、光学信号分析过程集成到微米尺度的微型空间内，不仅为某些复杂的科学研究提供一条新的思路，而且给人们建立了从微观角度进行多领域研究的桥梁。目前微流控技术虽然被广泛应用于光学系统中，但由于其发展的时间仍然有限，目前在该领域的研究仍面临诸多挑战。基于目前微流控技术的高速发展，我们有理由相信，未来微流控技术将会与光学系统更加紧密结合，两者相辅相成，在众多科研领域发挥更大的作用。
