对深层组织中细胞和亚细胞行为和功能的长期观察可以为病理学、免疫学、 神经科学、 细胞生物学、和发育生物学提供宝贵的见解。由于深度穿透的长波长和非线性特性 , 双光子显微镜 (TPM) 在过去几十年中随着各种动物模型的发展促进了许多重要发现。然而，点扫描策略、累积的光毒性和光学像差导致时空分辨率 、成像体积和成像持续时间之间存在不可避免的权衡，限制了对跨多个空间和时间尺度的复杂生物现象的全景理解。例如，很难在免疫反应或记忆形成的整个过程中追踪细胞迁移或神经放电。将这些瞬时细胞或亚细胞动力学与长期生理发病机制联系起来的仪器开发可能有助于在整体水平上了解生物系统的基本组织和功能机制。
尽管已经开发了各种高速三维 (3D) 双光子显微镜，但这些方法要么需要高激光功率来生成多个焦点，要么需要时空稀疏先验以用于特定应用(例如定位或神经网络重编码)。贝塞尔聚焦扫描TPM通过扩展景深 (DOF) 同时牺牲轴向分辨率来快速对大体积进行采样。此外，由于非线性响应，TPM对光学像差很敏感 。尽管自适应光学 (AO) 可以通过提高分辨率和信噪比 (SNR) 来解决问题，但它需要额外的波前传感器或空间光调制器来估计和补偿散射组织或不完美的成像系统中的波前畸变(由于空间不均匀像差，通常具有较小的有效视场)。因此，深层组织中的长期高速高分辨率三维成像仍然是一个未解决的系统性挑战。
基于此，清华大学的Zhifeng Zhao(一作)，Jiamin Wu(通讯)，Hai Qi(通讯)，Qionghai Dai(通讯)等人为了解决这些问题，同时最大限度地减少光毒性，提出了一种双光子合成孔径显微镜 (2pSAM)，通过使用针状光束捕获整个 3D体积的多个角度投影，而不是使用高数值孔径进行点扫描。实验表明，在长期连续成像过程中，传统 TPM 中累积的非线性光损伤被低估(即使激光功率远低于先前表征的安全阈值)。2pSAM不仅可以在深层组织中实现毫秒级的亚细胞三维成像，并显著降低光毒性（对应于比TPM 慢 1,000 多倍的光漂白速率），而且还显示出对各种光学像差的强大鲁棒性。凭借其功能，作者团队确定了创伤性脑损伤 (TBI) 后通过迁移体进行的直接细胞间通讯，可视化了免疫反应过程中生发中心 (GC) 的完整形成过程，并在小鼠长达一小时的高速大规模神经记录中揭示了异质细胞状态。
1)实验装置。光路包含传统双光子显微镜、mid-NA 2pSAM、min-NA 2pSAM三种模式，通过在光路中设置多个翻转反射镜完成光路的切换。传统双光子显微镜模态激发路径如图1中灰色光路和从G1到obj的共同路径，通过逐渐放大光路，让光束充满物镜的back pupil平面。
2pSAM模型分为一路高分辨率、小有效体积和低分辨率、大有效体积两路，其共同点是让光束进入三模态的共同路径G1到obj之前时，通过两个4f系统把光束直径逐渐缩小，即便经过后续扫描镜头和tube透镜的4倍放大，其光束直径仍然小于激光器的出射光束直径，从而在物镜的back pupil平面是一束非常细的平行光，不能填满back pupil平面，然后经过物镜聚焦形成很细的针形光束。这里子孔径NA和物镜NA的比值是通过调节4f系统的放大率来调节(两路2pSAM不同之处就在于L3透镜的焦距不同，即4f系统放大倍率不同)。
值得注意的是，必须放置一个针孔在第一个4f系统(L1的焦平面)里，以引入不同角度光束之间的相位相关叠层限制(这对于达到物镜全NA的衍射极限合成孔径至关重要)。针孔的大小要求接近子孔径激发光束的阿贝衍射极限(在试验系统的物镜平面，对于mid-NA是3.92um，对于min-NA是7.85um)。大的针孔直径会降低叠层限制效应，小的针孔直径会导致激光功率和景深损失。
对于2pSAM光路，还有一个关键点是需要放置一个快速偏转的反射镜(压电反射镜S-335,PI)在第二个4f系统的焦平面(L3的焦平面)来高速(200Hz)改变针形光束的角度。通过改变物镜共轭平面的角度，就可以扫描物镜的整个back pupil平面。在这里使用13个不同的角度。
2)具有DAO的三维重建。2pSAM不进行点扫描完成三维重建，而是采用相关的针形光束沿着不同角度完成对整个体积的扫描(类似光场显微镜的层析过程)，它的三维深度信息通过三维解卷积算法实现。
由于不同角度投影对应全物镜NA的不同子孔径，因此，这些角度投影测量值之间有畸变波前引起的不同的横向位移。这些角度测量之间的不一致与相应子孔径的波前梯度成正比，因此，不需要额外的波前传感器或传统自适应光学里的迭代反馈就能够评估由于组织中的不均匀折射率分布或不完美的成像系统引入的光学像差。这些像差随后可以用于在三维解卷积期间生成带像差的点扩散函数，以校正后处理中的像差。这个包含像差估计和校正的过程称为数字自适应光学(DAO，在单光子光场显微镜里已经被验证，但是在双光子成像里还未被探索)。
在这种情况下，可以在不降低成像速度的情况下，通过在重建过程中划分FOV，同时对空间不均匀像差进行多点像差校正。
实际操作时，使用ADMM(alternating direction method of multipliers)算法迭代更新像差校正三维体积和像差波前。
参考文献：Zhao et al., TWo-photon synthetic aperture microscopy for minimally invasive fast 3D imaging of native subcellular behaviors in deep tissue, Cell (2023), https://doi.org/10.1016/j.cell.2023.04.016
