数字液滴PCR图像的荧光信息提取

数字 PCR 聚合酶链式反应技术是应用于核酸检测的主要手段之一，随着微流控技术的发展，液滴技术以其体积小、精度高、反应腔之间完全隔离等优点在核酸检测中广泛应用。ddPCR 实验包含四个环节，即待检测样本与液滴的制备、目标核酸的扩增、荧光信号的采集、实验数据分析与处理。其中，荧光信号采集的精度将直接影响 ddPCR 实验的结果。

目前，荧光信号采集的方法有显微图像检测法和基于流式细胞术的荧光检测法，相较于后者，显微图像检测法的液滴破裂更少、精度更高、检测速度更快。ddPCR 实验的液滴荧光显微图像的特征是由大量大小相似，荧光强度不同的圆形亮点组成，影响实验结果的关键在于对图像中液滴的判别、分类与计数，即计算液滴的总数并读取各个液滴的荧光信号判断其阴性或阳性。图像斑点检测主要包括图像去噪声、增强目标斑点特征、斑点计数。常规的图像斑点计数通常使用图像灰度阈值分割的方法将图像二值化，再计算目标斑点对应区域的数量，然而这种单一阈值的图像二值化方法只适用于图像背景均匀且目标点单一的情况；在多目标的检测中，这种方法的误差会随着检测目标种类的增多而增大，由于实验中的液滴数量多、尺寸小、排列紧密、荧光强度不均匀，导致液滴难以计数。

针对此问题，河北工业大学 李姗姗 教授团队提出一种数字液滴 PCR 图像荧光信息提取方法，该成果作为封面文章发表在《光学 精密工程》（EI、Scopus 收录，中文核心期刊，2021 中国国际影响力优秀学术期刊）2022 年第 7 期上。

论文信息

李姗姗,王子超,于成壮等.数字液滴PCR图像的荧光信息提取[J].光学精密工程,2022,30(07):821-829.

https://ope.lightpublishing.cn/thesisDetails#10.37188/OPE.2022‍3007.0821

《光学 精密工程》 2022 年 第 30 卷 第 7 期 期刊封面图

问与答（Q&A）

采访人：曹金（《光学 精密工程》 科学编辑）

受访对象：李姗姗（河北工业大学 教授）

 

1

 

Q：请介绍一下数字液滴 PCR 技术及其特点。

A：数字液滴 PCR 技术是继第一代凝胶电泳 PCR、第二代荧光定量 PCR 之后的第三代 PCR 技术。该技术可以将待检测样本分成几份到数万份，将其分散到数以万计的微液滴单元中，每个单元内包含一个或多个拷贝的目标核酸分子，在每个液滴反应单元中分别对待检测核酸分子进行扩增，使其达到足以被检测出的含量，并使用荧光标记物对核酸分子进行标记。分别统计有强荧光信号的液滴以及弱荧光信号的液滴数量，最终根据泊松分布原理以及阳性微滴的比例，计算出待检测核酸分子的浓度或拷贝数。

2

Q：在核酸检测领域，数字液滴 PCR 具有哪些优势，特别地，在目前的新冠病毒检测中，该技术发挥了什么作用？

A：数字液滴 PCR 是一种核酸分子的绝对定量技术，与第一代、第二代 PCR 技术相比具有很多优点。首先，数字液滴 PCR 不依赖于 Ct 值和标准曲线，所以它不受扩增效率的影响，也不需要进行标定，就完全可以根据泊松分布原理直接计算出待检测样本的起始浓度，可以说是一种真正意义上的绝对定量的核酸检测技术。

其次，数字 PCR 技术可以对超低浓度的样本进行绝对定量检测。理论上讲，哪怕样本里面只含有一个 DNA 片段，也可以被准确检测出来。所以，和传统 PCR 技术相比，这个技术在痕量核酸样本的检测实验、单细胞的基因表达检测实验、核酸基因极少量突变检测、核酸极微小表达差异检测等方面，具有更高的灵敏度和特异性。

实际上，数字液滴 PCR 在病毒诊断领域已经发挥了巨大的作用，近期肆虐的新型冠状病毒、奥密克戎病毒的传播能力比 SARS 更强，疫情传播速度较快，给疾病防控工作带来极大的挑战。国家卫健委发布的新冠肺炎诊疗方案指出，呼吸道等标本荧光 PCR 检测新冠病毒核酸阳性是确诊方式之一。针对新冠病毒进行准确、可靠的检测技术，已成为应对疫情的紧急重点研究方向，数字 PCR 的绝对定量能力正好可以满足这一需求。

3

Q：本文针对数字液滴 PCR 实验中液滴难以计数的问题，提出了一种图像处理方法，该方法的特点是什么，与以往算法相比，具有哪些优势？

A：我们在进行数字液滴 PCR 图像处理的时候，往往需要根据一些特征参数来对感兴趣的阳性液滴和阴性液滴进行区分。其中，液滴的灰度是一种很好的辨别因素，通俗来说，阳性液滴会比阴性液滴更亮一些。但是，如果想要判断一个液滴是阳性还是阴性，必须给出一把尺子，作为明确的判断标准，也就是阈值。实际上，如果阈值的取值不同，我们计算出来的阳性液滴的数量是会有变化的，所以这个阈值的选择就非常关键。

我们采用了一种比较“笨”的方法来确定这个阈值。灰度的取值是 0～255，让这 256 个数字依次作为阈值，对液滴的图像进行二值化处理。当然，目前一台普通计算机的算力是完全承受得起这样的暴力求解方式的。然后，把液滴尺寸和圆度作为另外的两把尺子，来识别液滴。这样遍历下来，就得到了 256 个可能的答案。那么到底哪一个是正确的答案呢？我们对这些点进行差分处理，或者说，对这些点连成的曲线进行微分处理，根据差分或者微分的极值点，就能判断出合理的液滴计数结果。

和以往的算法相比，我们的算法显得“笨拙而勤奋”一些，但是它能够降低阈值选择的主观性，对于阳性液滴的计数效果非常符合预期。

4

Q：在应用过程中，阈值的设置是需要人工干预的，具有不确定性，未来能否考虑机器学习的方法来进一步提升算法性能，如何提升。

A：本文采用常用的数字信号处理相关技术对原始图像进行降噪，提高图像对比度，进而实现二值化、完成预处理。但是在应用过程中，阈值的设置是需要人工干预的，具有不确定性，因而应用推广受限。实际上，我们已经在探索新的、更加聪明的人工智能图像处理方法了，例如，采用机器学习聚类分析的方法对液滴进行分类。 

5

Q：请系统地介绍一下您课题组在微流控芯片所做的代表性工作和成果。

A：针对微流控芯片技术，我们课题组在低浓度生物标志物的检测用敏感单元等应用基础研究方面进行了一些探索。同时，也开发了相应的小型化智能机电装备，利用电学、光学手段，把微流控芯片应用到牛奶的体细胞检测、藻类检测等领域。

课题组成立之初，我们深受微加工的高门槛之苦，索性摸索出一系列低成本的微加工方法，掌握了一些常用微流控器件的低成本标准化加工工艺流程，这些工艺对于处于起步阶段的“青椒”非常宝贵。

近期，我们在 Analytical Chemistry 期刊发表了一种基于单层光刻技术构建的微流控阶梯乳化系统，用于生成高密度液滴阵列，对于拓展液滴式数字 PCR 的应用场景有重要意义。感兴趣的朋友可以关注这项工作（Anal. Chem. 2022, 94, 9, 3939–3947）。该工作采用集成化设计，将液滴生成、液滴平铺、热循环、荧光检测集成，能够在 40 分钟内完成样品检测，极大简化了操作步骤，提高了检测效率。这种技术的主要优势有两点：一是基于单层光刻工艺实现了传统上双层光刻工艺才能解决的阶梯乳化液滴生成功能；二是无需提取油相，液滴生成后，存储腔中内相流体（PCR 反应体系）的体积占比高达 72%，为构建高密度的液滴阵列、保留后续检测单元集成的预留空间提供了解决方案。此外，该器件在重复性、稳定性和检测精确性等方面也表现优异。

此外，针对数字液滴 PCR 核酸技术，我们开发了一种可靠的、标准化微加工流程，用来制造按需尺寸的锥形玻璃毛细管。在常规的玻璃管拉制完成之后，利用化学刻蚀、机械抛光的微加工手段，可以得到表面光滑、尺寸可控的毛细锥管。相关工作发表在近期的 IEEE JMEMS（DOI:10.1109/JMEMS.2022.3163281），以及早期的 JMM 期刊（J.Micromech. Microeng, 2019, 29 037001）上。

团队负责人

李姗姗，教授，2014 年于哈尔滨工业大学获得博士学位，美国田纳西大学、哈佛大学访问学者，IEEE 会员，中国微米技术学会高级会员。主要从事微流控芯片、智能传感与检测、微系统集成等方面的研究。入选天津市特殊支持青年拔尖人才计划、河北省高等学校青年拔尖人才计划，河北省三三三人才等项目。

李军委，副教授，2015 年于河北工业大学获得博士学位，主要从事微传感与检测、药物筛选等方面的研究。E-mail: junwei_li@hebut.edu.cn