撰稿人 | 雷佳鑫
TITLE | #使用双波长激发荧光定量测定肿瘤深度#
由于增加了穿透深度，用荧光引导的手术方法量化实体肿瘤边缘是一个挑战，特别是当使用近红外（NIR）波长时。作者开发了一种NIR双波长激发荧光（DWEF）方法，它利用组织中光的波长依赖性衰减来确定荧光团的深度。建立了一种便携式双波长激发荧光成像系统，并与NIR肿瘤靶向荧光团并行地在模拟乳腺癌幻影、鸡组织和体内小鼠模型中进行了测试。该系统在所有实验中均显示出较高的精度。这种方法的低成本和简单性使其成为临床应用的理想选择。
实时术中成像通过在整个手术过程中提供精细解剖和肿瘤边界的连续视图，有助于最小化对神经或大血管的意外损伤造成的伤害，并有助于划分癌变组织以进行完全切除，同时保留附近的健康组织。荧光引导手术（FGS）能够用更便宜和紧凑的硬件实现实时、无接触、高对比度的图像。这些特点使得FGS能够扩展到农村和服务不足的社区。
将FGS应用于边缘评估的一个关键挑战是，所选的成像技术必须能够定量测量完整切除标本表面下几毫米处的癌细胞深度(图1)。FGS方法通常利用近红外（NIR）荧光染料，它可以在组织表面以下1-2厘米处检测到。在概念上和技术上，最便宜和最简单的技术是比率荧光成像，它利用组织中光的波长依赖性的衰减来提供独立于荧光团浓度的深度信息。这种方法使用最小的硬件和基本的数据处理，因此具有很高的成功转化为肿瘤手术的潜力经济和环境。比率荧光成像最近被用于FGS，从暴露的脑表面，基于使用5-氨基乙酰丙酸后，肿瘤中可见荧光团的选择性积累，从暴露的脑表面确定脑肿瘤的深度。
图1.(A)完全切除的实体肿瘤周围的健康组织边缘需要完全切除。(B)荧光引导手术（FGS）可以帮助实现全边缘，但目前还不能从表面确定肿瘤的深度。
这种比率荧光深度定位方法尚未用于NIR荧光剂，与组织自身荧光或外源性可见光谱剂相比，NIR荧光剂增加了对比度和穿透深度。本文，作者报道了一种使用肿瘤靶向NIR荧光团LS301的比率荧光成像策略，该策略选择性地与肿瘤中的磷酸化膜联蛋白A2过表达。这种NIR深度分析方法的关键优点包括简单的仪器安装、快速的图像处理和分析，以及改进的组织穿透性和肿瘤对比度，使其非常适合于FGS的临床翻译和整合。
3.1肿瘤靶向造影剂LS301
LS301是一种用NIR荧光团标记的八肽，可以选择性地与磷酸化的膜联蛋白A2结合，这是一种在多种类型的实体肿瘤中过表达的蛋白。该荧光团具有较宽的激发光谱，跨越∼650-810nm，使用荧光光谱仪测量。
3.2双波长激发下的荧光团深度测定
由于组织中的光吸收器和散射体的波长特异性特性，光强在可见光和近红外光谱中以不同的速率衰减。在用两种不同的激发波长照射荧光团时，每个波长的强度随深度的衰减基于控制斜率的组织光学特性，使得每个波长产生的荧光强度之比的自然对数（在数学上等效于自然对数的差异）与荧光基团的深度具有线性关系，重要的是，该比率也与浓度无关。
A)光的波长依赖性的衰减以及与不同浓度的荧光团的相互作用示意图（c1-深绿色，c2-浅绿色）。B)如果将两个激发波长730和780nm波长产生的荧光对数与两种不同浓度的荧光团的深度绘制，则单一深度产生四种不同的强度。C)然而，如果绘制出730和780nm激发下产生的荧光比的对数，那么每个深度都有一个唯一的溶液，无论浓度如何。（缩写：d-深度、c-浓度、I-荧光强度）绿色箭头对应于荧光团的浓度（深绿色-c1，浅绿色c2).相同的黑色箭头显示在d1和d2表明，每个激发波长产生的荧光强度的差异等于它们的比值的对数，与荧光团浓度无关
3.3便携式双波长激发荧光系统
使用730和780nmled构建了荧光成像系统。730和780LED照明使用笼式立方体和二向色滤光片对齐。一个高通滤波器被放置在相机前，以检测荧光光和拒绝激发光。使用850nmLED创建亮场图像，使荧光图像可以与被询问样本的真实视图相关联。相机还使用MatlabGUI进行控制，并获取每个感兴趣样品的730nm激发荧光、780nm激发荧光和850nm明场图像。
3.4比率荧光成像分析
GUI还通过执行快速图像分析，首先捕获730和780nm激发波长的荧光图像，以解释LED照明剖面的空间差异。每个宽视场幻影图像都使用一个阈值进行分割。只有两个led都满足阈值的像素被包括在内用于后续分析，这定义了730和780nmled的成像区域。分割后，对每个荧光参考值进行广角场校正，公式如下
然后将校正应用于所有随后的荧光图像。在广域校正后，对730和780对荧光图像进行其广域校正比的自然对数进行分析图像
可以通过将所有测量归一化为已知荧光团位于表面（深度=0）时进行的测量值来忽略y截距，例如荧光引导手术中的肿瘤表面：
如上所述，组织的光学特性可以用来计算斜率m，深度d可以求解：
3.5光学性能测定
使用具有单一光源和探测器对的漫反射光谱（DRS）测量光学特性，并使用积分球（IS）进行验证。漫反射光谱使用一到四个扇出光纤束进行。公共端的两根外光纤用于测量，它们的相对端连接到卤素灯或光谱仪。参考测量是使用大型Spectralon标准品进行的，该标准品在测量的波长下反射率为99%。定制的光纤支架被3D打印，以在2毫米的距离上垂直于Spectralon标准拍摄漫反射率图像。
之后在组织模拟模型、鸡分层研究和小鼠体内进行肿瘤边缘测定。
4.1合成组织模拟幻影和深度测定的验证鸡组织
定制的双波长激发荧光成像系统在确定合成组织模拟模型和鸡胸肉组织层下的NIR荧光团的深度时提供了较高的精度，如图所示。
图3.便携式双波长荧光成像系统在组织模拟幽灵和鸡组织厚度的增加下确定NIR荧光团的深度。A)实验装置示意图。比较B)模拟模型的合成组织和C)鸡组织下的荧光团的真实深度。
比率荧光成像数据用蓝色圆圈表示，用积分球体（IS）预测的斜率用黑色表示，用漫反射光谱（DRS）预测的斜率用蓝色表示。使用R测量了数据对DRS和IS预测的拟合优度。对组织模拟模型数据的线性最佳拟合线产生了拟合优度R2值0.99，突出了光的依赖衰减的线性。IS和DRS预测的拟合优度如图3(B)所示，产生R2值为分别为0.97和0.99。对组织模拟幻影的深度预测的平均误差为164µm，标准差为56µm。
在鸡肉组织实验中，荧光比的拟合优度与到线性曲线的深度为0.89。基于DRS推导出的光学性质的预测斜率为配合R2值为0.86，平均误差为0.47mm，标准差为0.29mm，在临床环境中误差最小。
4.2注射靶向荧光团的近红外肿瘤小鼠肿瘤模型深度测定的体内验证
在乳腺癌体内小鼠模型中进行双波长激发荧光成像，并将提取的透明边缘厚度与从切除肿瘤的离体荧光图像测量的透明边缘进行比较（图4）。
首先在体内（左图）获取荧光和双波长激发荧光图像，并创建强度和深度图。处死小鼠并切除肿瘤和周围组织。将肿瘤切下横平面，并对肿瘤核心进行成像以量化荧光标记肿瘤周围的组织边缘（右图）。轴向切片位置的位置用虚线显示在体内图像上。
DWEF在预测乳腺癌小鼠模型中的肿瘤深度方面具有很高的准确性。图5显示了每只小鼠的三种图像类型（n=4），其中包括将每个切除的肿瘤切成两半的体内标准780nm激发荧光SBR（第1列），体内DWEF（第2列）和离体荧光强度图像（第3列）和肿瘤边缘掩膜（第4列）-作为金标准边缘厚度。基于DWEF的清晰边缘厚度（在第2列虚线处提取）和切除的肿瘤边缘沿着与离体肿瘤轴向切片（第5列）相同的线绘制。
图5.体内双波长激发荧光（DWEF）成像提供荧光团深度，平均误差为340μm。
此外，从跨越离体轴向切片位置的像素捕获的DWEF和SBR结果（通过图5中第1列和第2列中的虚线显示）从所有四只小鼠中合并并绘制与离体金标准边缘厚度（图6）。在通过原点执行线性拟合时，使用DWEF实现了1.02的斜率，这表明DWEF能够量化绝对深度。相比之下，使用荧光SBR实现了2.194的斜率，与深度几乎没有关联。此外，计算了边缘厚度与DWEF和SBR结果之间的Spearman相关性，相关系数分别为0.68和0.22。
图6.与荧光信号与背景比（SBR）测量相比，体内双波长激发荧光（DWEF）在确定绝对裕量厚度方面具有很高的准确性。左）每只小鼠（M1-M4）的体内DWEF测量值与其相应的金标准肿瘤边缘厚度之间的相关性。右）荧光SBR与金标准肿瘤边缘厚度之间的相关性
本研究假设可以设计、构建一个简单的双波长激发荧光成像系统，并测试用于手术切缘的测定。作者成功地创建了该系统，并通过乳腺癌体内小鼠模型验证了其在组织模拟模型、鸡分层研究和肿瘤边缘确定研究中的性能。据作者所知，这是首次在近红外中实现这种方法，在近红外中，由于低自荧光背景，提高了荧光对比度，由于低组织散射和减少血红蛋白吸收，穿透深度得到提高。该系统具有较高的准确性，在组织模拟模型、鸡分层研究和小鼠体内肿瘤边缘测定方面的平均误差分别为164µm、0.44mm和0.36mm。此外，当与荧光信号-背景比的正面比较时，DWEF系统显示出优越的准确性和与深度的绝对对应，而SBR显示出较差的准确性，且仅与深度相对相关。最后，所提出的系统是低成本的，快速的(数据采集时间<5分钟)且便携。光学特性测定方法的进一步改进和数据捕获和分析的自动化将有助于加快临床转化的路径。
文章链接
https://doi.org/10.1364/BOE.468059
