本文介绍的是深圳大学物理与光电工程学院陈丹妮老师课题组在傅里叶光场成像系统中引入超分辨光学涨落成像技术，实现重建的三维空间分辨率得到有效地提高，论文发表在《Journal of Innovative Optical Health Sciences》期刊2023年第3期。
SOFFLFM: Super-resolution optical fluctuation Fourier light-field microscopy
超分辨光学涨落傅里叶光场显微成像技术
Haixin Huang, Haoyuan Qiu, Hanzhe Wu, Yihong Ji, Heng Li, Bin Yu, Danni Chen, and Junle Qu
傅里叶光场显微成像（Fourier light-field microscopy, FLFM）作为一种新兴的无扫描成像技术，其凭借较低的光毒性和快速的三维体积成像在生物医学领域得到了广泛的研究和应用。FLFM使用微透镜阵列（Micro-lens array, MLA）分割显微物镜的傅里叶频谱孔径，在成像面上形成多个不同视角的成像区域，从而在不扫描的情况下，通过三维反卷积计算重建出样品的三维结构。然而，FLFM的分辨率仍然受到光学衍射的限制，并且系统的分辨率依赖于傅里叶频谱孔径的划分无法超过宽场显微镜观察下的分辨率，这制约了FLFM在三维纳米分辨成像中的进一步应用。
本文在FLFM成像系统的基础上，提出了超分辨光学涨落傅里叶光场显微成像技术(Super-resolution optical fluctuation Fourier light-field microscopy, SOFFLFM)，其在不改变FLFM成像系统任何硬件设置的情况下，将具有超分辨率成像能力的超分辨率光学涨落成像技术(Super-resolution optical fluctuation imaging, SOFI)的思路引入到FLFM。SOFFLFM需要使用具有独立随机闪烁波动特性的荧光染料标记样品，通过对FLFM采集的时间光场图像序列进行累积量计算分析，最后进行三维反卷积迭代计算重建出空间分辨率更高的三维结构。理论上n阶SOFFLFM重建的空间分辨率相比于FLFM可以提高了
倍。仿真结果表明，相比FLFM,二阶SOFFLFM的仿真重建结果分辨率可以提高1.2-1.6倍，四阶SOFFLFM的仿真重建结果分辨率可以提高2倍以上。
图1：SOFFLFM系统原理图。（a）FLFM成像系统。（b）FLFM成像系统的部分剖面图。（c）位于光轴上不同轴向位置的两个理想点光源经过SOFFLFM成像系统所采集的时间光场图像序列
SOFFLFM的成像系统和传统FLFM一致。图1（a）（b）展示了FLFM的系统原理图，位于光轴上不同轴向位置的两个理想点光源经过FLFM成像系统中微透镜阵列的调制，其在成像面上呈现为具有横向偏移的两个弥散斑。假设在这两个理想点光源的位置标记上具有独立随机闪烁波动特性的荧光分子，即可通过FLFM成像系统采集时间光场图像序列如图1（c）所示。对图1（c）采集的时间光场图像序列进行累积量计算，具有横向偏移的两个弥散斑可以得到有效地缩小，从而使得SOFFLFM相比于FLFM经过三维反卷积重建后在横向和轴向重建的分辨率都可以得到有效地提升。
2.n阶累积量三维点扩散函数
图2：（a）FLFM三维点扩散函数；(b) 二阶SOFFLFM累积量点扩散函数；(c) 四阶SOFFLFM累积量点扩散函数；彩色标尺不同颜色表示为不同的深度，白色标尺表示1µm
考虑到FLFM系统的点扩散函数（Point spread function，PSF）是平移不变的，FLFM的三维PSF在二维平面的投影可如图2（a）所示。对于超分辨率光学涨落成像技术，n阶累积量计算理论上可以将分辨率提升倍。因此𝑛 阶SOFFLFM累积量点扩散函数可以表示为FLFM三维PSF的𝑛次方。图2（b）（c）给出了二阶SOFFLFM累积量点扩散函数和四阶SOFFLFM累积量点扩散函数在二维平面的投影图。
3.仿真的时间光场图像序列和各阶累积量光场图像
图3：（a）仿真获得的100帧SOFFLFLM采集的时间光场图像序列；（b）FLFM的仿真光场图像；（c）二阶SOFFLFM的仿真光场图像；（d）四阶SOFFLFM的仿真光场图像；白色标尺表示10 µm
我们对三维空间中随机分布的荧光分子进行模拟仿真来验证表征SOFFLFM重建后的荧光分子的三维分辨率。仿真样品（Initial Volume）为物空间焦面附近四个轴向间隔为0.5 µm的切面上随机分布的荧光分子，其三视图如图4（a）所示。对仿真的三维样品进行伯努利建模生成100帧强度变化的时间序列三维样品图片，每帧三维图片与系统的三维PSF卷积并添加上泊松和高斯噪声，即可得到经过SOFFFLFM系统采集的100帧光场图像时间序列（图3（a））。对光场图像时间序列进行一阶，二阶，四阶累积量计算即可得到FLFM（图3（b））、二阶SOFFLFM（图3（c））和四阶SOFFLFM（图3（d））的光场图像。经过二阶和四阶累积量的计算，相比于FLFM的光场图像，二阶和四阶SOFFLFM光场图像的分辨率都有明显地提高；同时，二阶和四阶SOFFLFM的光场图像背景噪声更低，这是由于具有高斯分布的背景噪声经过高阶累积量计算后累积量值为零，经过SOFI处理后的光场图像具有自动抑制高斯背景噪声的能力，累积量的计算有效地抑制了光场图像中的背景噪声。接着将这些光场图像与其对应的三维累积量点扩散函数进行三维反卷积迭代获得FLFM，二阶SOFFLFM和四阶SOFFLFM重建的图像。
图4：三维随机分布的荧光分子经过SOFFLFM重建的结果（a）三维仿真样品；（b）FLFM的重建结果；（c）二阶SOFFLFM的重建结果；（d）四阶SOFFLFM的重建结果；（e）b，c，d中黄色方框区域的放大图以及黄色虚线位置的切面强度曲线；（f）b，c，d中白色方框区域的放大图以及白色虚线位置的切面强度曲线；a, b, c, d中的白色标尺表示1 µm，e, f中的白色标尺表示0.1µm
图4（b）（c）（d）展示了FLFM、二阶SOFFLFM和四阶SOFFLFM重建的三维样品在x-y、y-z和x-z平面上的投影视图。从重建的结果上看，相比于FLFM，二阶SOFFLFM和四阶SOFFLFM重建不管在横向还是轴向分辨率都得到了较好的提高，在一些荧光分子分布较为密集的区域，二阶SOFFLFM和四阶SOFFLFM都能实现较好地分辨。在FLFM重建结果表现为互相重叠的两个横向间隔为0.40 µm的荧光分子在二阶和四阶SOFFLFM的重建中得到了较好的分辨（图4（e））。对于轴向间隔为0.50 µm的两个荧光分子，二阶SOFFLFM的分辨率提升不足以使得将其两进行区分，但在四阶SOFFLFM重建时，能较好地将这两个荧光分子进行分辨（图4（f））。
综上，SOFFLFM通过在FLFM系统的基础上引入高阶累积量的计算从而实现三维空间分辨率的提高的策略是有效可行的。
陈丹妮，深圳大学物理与光电工程学院特聘研究员。长期从事光学显微成像方法及应用研究，包括超分辨光学显微、大景深多粒子同时四维追踪、无标记光学显微等成像方法及应用。在Nanophotonics、OL、OE、BOE等期刊发表SCI论文40余篇。主持各类国家、省部级项目3项。授权国内发明专利10余件。
