撰稿人 | 刘畅
论文题目 | Visualizing the ultra-structure of microorganisms using table-top extreme ultraviolet imaging
作者 | Chang Liu (刘畅)， Wilhelm Eschen, Lars Loetgering, Daniel S. Penagos Molina, Robert Klas, Alexander Iliou, Michael Steinert, Sebastian Herkersdorf, Alexander Kirsche, Thomas Pertsch, Falk Hillmann, Jens Limpert, Jan Rothhardt
完成单位 | 耶拿亥姆霍兹研究所，耶拿大学，莱布尼兹自然产物与传染生物学研究所
在实验室尺度下中实现对生物组织的纳米量级高分辨率成像对药剂学，临床医学和生物学研究应用具有重要意义。其中使用极紫外光 (extreme ultraviolet, EUV) 作为成像光源的显微技术与主流的电子显微镜技术相比，除了同样实现纳米级分辨外，还具有高吸收对比度以及更长（微米级）的穿透深度，从而可以实现对复杂的内部结构进行成像。此外，由于元素周期表中的各种原子均有共振位于该光谱区域，极紫外光成像技术表现出了良好的元素特异性和材料对比度，从而使无标记方法研究生物中的细胞和亚细胞特征成为可能。
叠层成像技术作为近年来发展的计算显微成像技术，通过相邻位置重叠信息的扫描和衍射图样采集，计算机可以通过迭代算法找到满足所有衍射图样约束的唯一复数解，即样品和探针的复振幅信息。该技术能提供无标记，高分辨，宽视场的相位成像，同时具有无透镜的物理限制，体积小等优势，面向工业测量与生物医学的应用前景十分广阔。然而由于其对光源的高亮度和相干性要求，目前的无透镜极紫外及X射线显微镜大多依赖于同步加速器辐射和自由电子激光光源，极大限制了相干衍射成像技术的广泛应用。与此同时，由于极紫外光谱内特定波长对生物材料的穿透深度仍然有限，该光谱区域在生物组织成像领域的应用亟待探索。
台式极紫外叠层扫描显微镜为生物样本的无标记高材料对比度成像提供了可能性。来自德国耶拿大学Jan Rothhardt领导的联合研究团队将自研的高度稳定的高光子通量EUV光源（波长13.5 nm）与干涉稳定的叠层扫描成像（ptychography）技术相结合，对干燥未染色的微生物样本——构巢曲霉真菌幼体和大肠杆菌细胞进行了高精度和材料特异性成像。同时，提出了位置相关的红外照明叠层扫描方法，实现了毫米级的大视场成像与针对选定区域的纳米级分辨率（< 60 nm）。最后，通过分析采集的图像散射振幅和相位，提取并鉴别生物样本内部材料组分信息，从而实现了对微生物亚细胞特征（如真菌的顶体）的识别。PhotoniX 期刊于2022年1月24日在线发表了相关研究成果。
本文主要展示了首次在极紫外光刻节点（EUVL）波长下对微生物样本的叠层成像技术成果。该台式无透镜显微镜采用了高能红外超快脉冲聚焦氩气等离子体的高次谐波产生（High harmonic generation）方法激发稳定高通量的极紫外光，通过一系列Mo/Si和Mo/Be镀膜的反射镜选择出特定波长13.5 nm的光子作为照明光源。掩模和样品都放置在具有主动干涉稳定功能的二维定位扫描平台上，从而实现了长时间的稳定扫描功能。获得高分辨率的关键因素之一在于样品前放置了一个螺旋形振幅掩膜（如图1 c 所示），通过构造探测结构光和散射光来增加探针所含信息量并且放宽探测器的动态范围要求，从而使后续的相位恢复图像重建算法能更快收敛到唯一解并显著提升重建图像的质量，克服了传统EUV聚焦光的局限性。在重建算法方面，多模态探针（multi-mode）与正交探针弛豫（orthogonal probe relaxation）相结合的重建算法在很大程度上提高了对显微镜系统不稳定性的容忍度并消除了重建结果中可能的伪影（artifact），提高了样品重建复振幅信息的可信度。
图1 a,b 台式极紫外叠层扫描显微镜光路概念图（包含共轴红外扫描）；c 氮化硅薄膜上的红外和极紫外光螺旋结构掩膜（电子显微镜图像）；d，e 红外和极紫外光探针在掩膜平面的重建复振幅图像。
本文另一个创新点在于解决了极紫外无透镜成像提前定位兴趣点（Region of interest）的问题。相干衍射成像技术的视野受波长，样品至探测器间距以及探测器像素尺度的限制。由于波长较短，极紫外光成像的视场一般局限于微米量级，想要获得毫米级别的大视场就需要较大的扫描面积，并对系统长时间稳定性提出了极高的要求。此外，由于整个探测处于真空密闭环境下并且扫描所得为衍射图样，对样本的兴趣点提前定位也面临困难。本文提出的共线红外叠层扫描方法巧妙地解决了这个问题（光路如图1 a, b 所示）。以制备在氮化硅薄膜样本上的构巢曲霉真菌幼体为例，利用高次谐波产生设备中红外光与极紫外光共轴的特点，先用红外结构光进行样本扫描获得分辨率较低的毫米级视场概览图像（如图2 a IR大图所示），同时通过误差补偿计算可以精确获得图样中兴趣点的坐标，将样品平台移动至该兴趣点进行高精度的极紫外光扫描显微（如图2 a XUV小图所示），重建出真菌簇（clusters）和单个菌丝（hypha）的高精度透射图像，其半间距分辨率可达到接近衍射极限的58 nm。通过图像我们可以观察到，得益于EUV 光子的高通量和其对典型生物材料的穿透能力，微生物细胞的内部结构清晰可见，并且显现出良好的材料对比度。
为了进一步探究极紫外波段显微技术的材料特异性，重建的单个菌丝的定量复振幅透射函数被用来计算散射参数（scattering quotient）。散射参数的计算抵消了样品厚度带来的复振幅变化，直接揭示了样品图像在每个像素上沿着传播方向的平均材料组分。将计算所得值与生物材料的标准值相比对可以识别生物组织内亚细胞单位的功能单元。例如，根据比对发现该菌丝尖端的散射参数可与磷脂的参数相比拟，代表着该区域是富含磷脂的区域，称为顶体（Spitzenkoerper），是真菌的细胞生长点（如图2b所示）。同样地，大肠杆菌作为原核细胞的模型也被用作成像的样品。图 2c 显示了重建的大肠杆菌菌落图像和包含两个处于分裂状态的细胞区域的散射参数图。散射参数的分析表明细胞壁主要由碳水化合物组成，而周遭的物质则被认为可能是富含多种蛋白的壁膜间隙（periplasm）。
图2 a 构巢曲霉的红外重建概览复振幅图像及位置相关兴趣点的高精度极紫外重建复振幅图像；b 单个菌丝的振幅，相位以及散射参数图；c 大肠杆菌样本的极紫外重建复振幅图像以及可能处于细胞分裂状态的大肠杆菌散射参数图。
本团队研发的高性能台式EUV层析显微镜在高分辨率，材料敏感的生物成像方面具有独特的优势。通过稳定的叠层显微成像技术与先进的重建算法相结合，对样本重建透射函数的定量振幅与相位分析成为可能，从而进一步通过散射参数分析强化了显微镜的材料特异性能。且通过共线双波长叠层成像实现了在无透镜成像中大视场概览与标记兴趣点定位的功能。在此基础上，EUV叠层成像技术与其他显微技术（如荧光显微镜）或其他波段（如水透明窗口，波长2.34 – 4.4 nm）结合的多模态显微成像技术将是未来工作的方向。
刘畅，德国耶拿大学应用物理所和耶拿亥姆霍兹研究所博士研究生，主要课题为台式EUV与软 X 射线源开发和计算显微技术在生物成像领域的应用。主要研究方向为运用短波叠层扫描成像，多模态成像等技术解决细胞生物学中的实际应用问题。
Wilhelm Eschen，德国耶拿大学应用物理所和耶拿亥姆霍兹研究所博士研究生，主要从事台式EUV光源搭建与计算显微技术的研究工作，在极紫外高次谐波产生以及相干衍射成像技术方面具有丰富的研究经验。相关研究成果在Light:science&application, PhotoniX, Comunication Physics, Optics Express, Optics Letters等期刊发表。
Dr. Jan Rothhardt，德国耶拿大学应用物理所和耶拿亥姆霍兹研究所研究员，领导耶拿亥姆霍兹研究所软X射线光谱学和显微学课题小组，也是耶拿亥姆霍兹研究所的扩展董事会成员。小组专注于高光子通量EUV和软X射线源的开发和应用。研究领域包括基于脉冲激光高次谐波产生的短波长光源，纳米尺度的成像技术以及分子和高载荷离子超快XUV光谱学。
Prof. Dr. Jens Limpert, 德国耶拿大学物理与天文学学院应用物理所教授，耶拿亥姆霍兹研究所(Helmholtz Institute Jena)和弗劳恩霍夫应用光学和精密工程研究所(Fraunhofer Institute for Applied Optics and Precision Engineering)的理事。Limpert教授领导的光纤和波导激光课题组长期推动激光技术特别是光纤激光器的进一步发展，研究发明了基于微纳结构的新型大模态光纤，并实现了高重复率超快光纤激光系统的显著功率提高以及光参量相互作用和高次谐波生成的新概念，并将成熟的高功率光纤激光系统深入应用于科研与工业界。围绕上述研究内容在激光物理学相关领域发表期刊论文五百余篇，被引20000余次，H因子82。Limpert 教授也是德国物理学会（Deutsche Physikalische Gesellschaft，缩写DPG）和美国光学学会（OSA）的成员。
发表于：PhotoniX
论文链接：
https://photonix.springeropen.com/articles/10.1186/s43074-023-00084-6
文献检索：
PhotoniX 4, 6 (2023). https://doi.org/10.1186/s43074-023-00084-6
