Nat. Photonics|荧光显微的原位超分辨引擎

本文由论文作者团队投稿

超分辨成像技术的出现标志着成像领域对于光学衍射极限的突破，也极大地推动了生物医学领域的发展。利用超分辨技术，生物学家得以对病态细胞内的亚细胞结构进行精准的量化统计和直观的可视化分析。然而，常见的超分辨技术却难以应用于医学和病理学中的大规模筛查场合，其主要面临以下两点瓶颈：

（1）需要复杂的采集设备和特定的成像控制，有些技术还伴随强烈的光毒性，难以满足活细胞成像的需求。

（2）为了提升空间分辨率，需要一定数量的原始数据进行重建，牺牲了时间分辨率，成像通量不足，难以满足高通量筛查的需求。

上述因素限制了超分辨成像技术在生物医学中广泛的应用，亟需开发一种能设备简单、适配性强、成像通量高的活体超分辨技术。

常见的超分辨方法如单分子定位显微镜（PALM/STORM）、受激辐射损耗显微镜（STED）等，其需要复杂的采集设备和特定的成像控制，并且时间分辨率低，成像通量不足，这些因素限制了超分辨成像技术在生物医学中广泛的应用。

超分辨光学涨落成像（super-resolution optical fluctuation imaging，SOFI）技术虽然对单分子闪烁和光化学环境的要求不那么严格，具有更快的成像速度，但仍需上千帧数据去重建超分辨率图像，限制了时间分辨率和成像通量，无法满足生物医学中大视场和细胞器瞬时动态等研究的高通量成像需求。

 

近日，哈尔滨工业大学赵唯淞/李浩宇团队与北京大学陈良怡团队合作提出可以利用预解卷积技术对图像进行处理，以提升荧光涨落现象的开关对比度，从而将重建所需的原始图像数量缩减至少两个数量级。同时在计算自相关累积量后再次进行解卷积，以进一步提升结果的分辨率。

基于上述原理，他们发明了自相关两步解卷积超分辨成像（Super-resolution imaging based on Auto-Correlation with TWo-step Deconvolution，SACD）方法，在不使用无需额外硬件的条件下，实现了目前活细胞中通量最高的超分辨成像。在SOFI的基础上提升了约50倍时间分辨率，只需要20帧，即可就能实现2~3倍的三维空间分辨率提升。

该成果于2023年9月1日作为封面文章发表在Nature Photonics上，题为Enhanced detection of fluorescence fluctuations for high-throughput super-resolution imaging。哈尔滨工业大学赵唯淞助理教授为论文第一作者，哈尔滨工业大学李浩宇教授和北京大学陈良怡教授为论文的通信作者。其中，论文共同第一作者还包括北京大学赵士群副研究员、哈尔滨工业大学博士研究生韩镇谦和丁相妍，共同通信作者还有哈尔滨工业大学丁旭旻教授和京津冀国家技术创新中心/北京大学郭长亮副研究员。哈尔滨工业大学谭久彬院士为论文共同作者。

SACD的原理与优势

该团队建立了荧光成像的前向传播模型，在真实的实验中，荧光信号不仅包括焦内荧光分子，还包括焦外和胞质溶胶荧光背景。然后，伴随背景的荧光涨落信号被显微系统的PSF卷积，并由传感器采样。在这一过程中，荧光信号的实际测量值将始终偏离SOFI所需的波动模型，使得原始图像中的信息利用率不高。故研究提出了自相关两步解卷积超分辨成像（SACD）方法（图1），首先对原始图像执行预解卷积，这一独特的处理增强了荧光信号的开关对比度，抑制了背景噪声，使得计算自相关统计量所需的原始数据帧数显著减少。同时在计算自相关累积量后再次进行解卷积，以进一步提升结果的分辨率。

图1：SACD原理与流程

图源：Nature Photonics 17, 806–813 (2023)

细胞骨架-微管蛋白成像

不同于与传统结构光显微镜的成像深度受限不同，SACD技术应用在于转盘共焦显微镜上可以实现深层细胞中的三维分辨率扩展。首先，该团队测量了其三维分辨率（图2左），将单个荧光探针颗粒随机分散在基底上，并通过转盘共焦显微镜观测。该团队测量出该点源的横向/轴向的半峰全宽为325/655纳米，在使用SOFI的重建结果中为296/510纳米，而在使用SACD重建结果中为135/33纳米（均使用20帧重建）。这表明，SACD可以在三维上有效地实现超过两倍的分辨率提升。

图2：SACD三维深层次超分辨成像

图源：Nature Photonics 17, 806–813 (2023)

接下来，该团队通过对细胞骨架微管的成像来展示SACD真正的三维超分辨能力。由于SACD不需要特定的光学照明和配置，可以直接使用sCMOS整个相机平面来实现三维超分辨成像，其相比于现有的商业SIM（白色虚线框）拥有进而具备更大的视场范围。利用这一点优势，该团队在深度达9微米的范围内同时对多个COS-7细胞进行了成像，并实现了两倍~三倍分辨率提升（图2右），在三维空间中达到三维超分辨的效果。

固定样本的超大视场高通量成像

团队将SACD方法与商用转盘共焦（Spinning Disk Confocal，SDC）系统相结合，实现毫米级（2毫米×1.4毫米）视场的微管高通量超分辨成像，包含多达2000个细胞（图3），并且平均分辨率由442nm提升至128nm。相比SOFI需要将近半天时间才能完成超分辨成像任务，SACD仅需10分钟便可达到更优的成像分辨率。局部放大图和峰值分析展示了SACD重建图像具有更高的空间分辨率，能够解析出转盘共焦系统和SOFI无法得到的细节信息。

图3：SACD高通量超分辨成像（图中缩写：SMLM单分子定位显微技术；STED受激发射损耗显微技术；SOFI传统光学涨落成像技术；SIM结构光成像显微技术。）

图源：Nature Photonics 17, 806–813 (2023)

活细胞中的四维动态高通量成像

团队在SACD方法的基础上引入此前开发的稀疏解卷积技术，通过时空上的连续性和稀疏性约束最大限度地利用原始图像信息（Sparse-SACD），实现对COS-7活细胞线粒体外膜超过10分钟的四维超分辨成像，线粒体被解析为中空的膜状细胞器，其裂变和融合的精细变化过程被清晰地展现出来（图4）。

图4：SACD活体四维超分辨成像

图源：Nature Photonics 17, 806–813 (2023)

总结与展望

形象地说，分布在荧光背景中的单个分子波动信号就像“迷雾中闪烁的星星”，SACD在计算统计量之前尽可能地消除了这种“迷雾”，以便在真实的生理环境下实现高质量的超分辨成像。通过充分利用原始图像中的荧光涨落信息，SACD打破了现有超分辨技术的通量限制以及需要特殊光学控制的设备限制，同时其能够直接应用于现有商业化共焦荧光显微镜系统（或其他任何荧光系统）中，有助于低成本、高通量地进行相关生物医学研究，有望成为生物学家分析细胞结构和瞬态动力学的常规工具。

SOFI技术的发明者，德国乔治-奥古斯都-哥廷根大学教授J. Enderlein是该工作的审稿人之一。J. Enderlein表示：“在涨落分析之前进行预解卷积的想法很新颖，非常合理，因为这应该是消除虚假涨落的好方法”、“使用这种技术呈现的图像质量非常好”、“我认为所提出的方法会是更优的”。奥克兰大学的David Baddeley教授在Nature Photonics 的News & views栏目上做特邀评述报道该项工作，评价该高通量超分辨成像技术“极有价值”。

最后尽管SACD在高阶累积量的分析中也有显著的效果，但由于高阶累积量对荧光涨落的敏感性和更大的原始图像数量需求，限制了其在活体成像中的应用。故目前SACD方法主要使用二阶累积量提取超分辨信息，未来的研究可聚焦于使用高阶SACD的活体超分辨成像方法，其将进一步满足生物医学上对于高通量筛查的成像需求。

论文信息

Zhao, W., Zhao, S., Han, Z. et al. Enhanced detection of fluorescence fluctuations for high-throughput super-resolution imaging. Nat. Photon. 17, 806–813 (2023).

https://doi.org/10.1038/s41566-023-01234-9