南开大学潘雷霆教授课题组：基于二维图案化技术的单细胞操控

光刻图案化技术（Photolithographic micropatterning）来源于半导体工业，其通过紫外光照射刻有镂空图案的掩膜，在事先涂有光刻胶的基底上刻蚀出相应的图案，经过后续的表面处理，包括显影，清洗，蛋白覆盖，聚乙二醇（PEG）或其衍生物表面钝化等过程，创造出细胞可黏附-不可黏附区域交错的基底，从而实现单细胞黏附位置与形状的精确控制（图1a）。光刻图案化技术的优点是图案精确度高，可批量生产图案化芯片基底，缺点则是需要昂贵的光刻设备。

②微接触印刷图案化技术

微接触印刷图案化技术（micro-contact print micropatterning）也被称为软光刻技术。该技术首先需要具有三维结构的硅阳文模板，通过在上面浇筑PDMS聚合物形成与之互补的stamp，再利用stamp在基底上压印出事先设计好的图案（图1b）。微接触印刷技术的优点是成本较为低廉，且操作较为简便，缺点则是图案的精确度相对较低。

细胞骨架（cytoskeleton）主要包括微丝（actin），微管（microtubule）和中间纤维（intermediate filament），在细胞生命过程中发挥重要作用。微丝作为动态性最强的细胞骨架成分，富集于细胞的边缘且与基底具有复杂的相互作用。因此大量研究以微丝骨架作为细胞图案化调控的主要靶点。近期的研究表明，某些细胞受到圆形图案限制，微丝骨架会展现出左右对称破缺的形态，这与单个微丝组装时的手性相关（图2a）。此外，圆形图案化限制还会诱导细胞产生微丝骨架的逆流行为（图2b）。不同形状的ECM基底图案会直接决定后续细胞微丝应力纤维的生成方式和稳定状（图2c-f）。中间纤维（图2g,h）和微管作为细胞中刚性较强的细胞骨架成分，目前作为图案化调控靶点的研究较少，且多局限于微管组织中心（MTOC）等特殊结构。

ECM的性质一直以来都被认为是调控细胞迁移的重要因素。研究者使用一维直线条带来限制细胞的迁移路线，并研究细胞迁移的速度与条带宽度、弯曲度以及蛋白密度的关系（图3a-c）。除连续条带外，一些非连续性图案，例如直线排布的三角阵列、梯子状图案和交替式黏附条纹，也被用来研究细胞感知ECM并决策迁移的方式和机制（图3d-f, h）。此外，利用可释放的黏附图案操控细胞的初始形状，研究人员发现细胞初始状态可以决定其后续迁移方向，这可能与细胞骨架的调控相关（图3g）。近期潘雷霆研究组构建出交替式黏附-非黏附图案化基底，发现巨噬细胞可在非黏附区以颠覆传统认知的间充质模式迁移，拓宽了人们对细胞迁移行为的理解（图3i）。

早期研究发现图案化限制可以直接影响细胞骨架，进而诱导细胞增殖、分化、调亡等。这种“自上而下”的策略可以调控巨噬细胞M1型和M2型之间的相互转化（图4a）。单细胞图案化还被用来调节间充质干细胞、神经细胞、星形胶质细胞等的分化（图4b-e）。图案化限制还被发现可以促进核仁的融合和染色质的凝聚状态，进而调节某些基因的表达情况（图4f）。近期，两个独立的研究组分别发现空间挤压可以打开细胞核膜的褶皱，促进花生四希酸的合成和下游钙离子信号通路的激活，进而促进肌球蛋白收缩和细胞迁移（图4g）。这也为空间限制—基因表达—细胞行为提供了新的机制解释。

细胞间通讯具有多种形式，例如自分泌、旁分泌、间隙连接、通道纳米管等。传统培养条件下，细胞在基底随机分布，体系难以控制，而细胞图案化可以精确操控细胞在基底的空间分布，为可控、定量研究细胞间通讯提供了有力工具。例如，通过泳道型图案可以量化接触依赖性细胞间钙波（图5a, b）。此外，潘雷霆课题组设计制作出同心圆图案，可视、直接、定量地证实了离散细胞间钙波通讯行为存在信号中继放大传递机制，扩大信号传递范围，提高信号传递速度和效率（图5c），还利用哑铃状图案揭示了两个处于有丝分裂末期的子细胞可通过细胞间桥以直接和间接的方式传递钙波等（图5d）。类似地，通过图案化研究间隙连接介导的Ca²⁺反应，发现骨细胞网络显示出比成骨细胞网络更敏感和动态的特性（图5e）。