Light | 徐涛/纪伟团队在多色超分辨显微成像技术领域取得新突破

内容来源：大屯路15号（中科院生物物理所）

单分子定位显微镜（Single molecule localization microscopy，SMLM）通过结合光控荧光分子标记、质心拟合算法、单分子检测等技术，将荧光显微镜的分辨率提高了一个数量级，实现了对细胞纳米结构的解析，已经被广泛应用于细胞生物学的观察研究中。但其在多色成像的拓展应用一直受到限制，主要原因是目前性能优异的光控荧光分子探针(如Alexa Fluor 647, CF660C等)大都集中在远红波段，很难采用常规的基于带通滤光片选择的办法来实现多通道成像。

ExR-STORM显微镜提供了一种单分子识别新方法，并进一步提高了单分子光谱拆分能力。该技术通过使用620 nm，639 nm和671 nm三个波长激光激发远红荧光探针，把激发光谱的特征作为单分子的“指纹”，以实现多色成像。

该方法的关键技术创新是设计了高频振镜分时同步快速成像光路，可以消除单分子闪烁导致的强度变化影响（图1）。

图1. ExR-STORM工作原理，利用振镜将三个激光器激发下的图像投影到相机不同区域，实现高频分时同步快速成像。

这个设计也为单分子激发谱的测量提供了新的思路。使用ExR-STORM显微镜结合四种远红探针的标记，成功实现了对细胞内线粒体、中间丝、内质网、微管等结构的四色超分辨成像（图2）。

图2. 用CF660C, Alexa Fluor 647, Dyomics 654 和DyLight 633标记线粒体、中间丝、内质网和微管，实现四色单分子定位超分辨成像。

成像结果表明该技术具有光谱拆分能力强、色差导致的定位误差小等优点，在细胞器互作、生物大分子共定位分析等生物研究领域具有广泛应用前景。同时该技术的样品制备方法及成像流程与常规STORM技术兼容，使该技术同时具备高性能以及易用性，有利于该技术的推广及应用，为生物及医学领域的研究提供了有力的成像工具。

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