在光学显微领域，3D成像在生物医学与生命科学等方面扮演着重要的角色。近日，南京理工大学左超教授团队提出了一种基于彩色复用强度衍射层析的3D无标记显微术，相关研究成果以Single-exposure 3D label-free microscopy based on color-multiplexed intensity diffraction tomography为题发表在Optics Letters期刊上。
折射率（Refractive index, RI）分布可以用来确定细胞结构和细胞的生物物理特性，最广泛使用的折射率测量技术为光学衍射层析术（Optical diffraction tomography, ODT）。ODT虽然可以实现单次曝光3D折射率重建，但需要在能够精确控制的光学设备中实现，且需要使用相干激光源和机械角度扫描。同时，角度复用还存在频谱混叠的问题，限制了成像系统的有效数值孔径。另外，3D RI 层析可以通过在对称或不对称照明下使用轴向扫描进行强度测量来实现。然而，轴向机械扫描可能会导致位移误差，延长采集时间，限制了3D成像的时空分辨率。
在这项工作中，作者提出了一种单次曝光强度衍射层析术（Single-exposure intensity diffraction tomography, sIDT），通过利用环形彩色复用光源代替传统的LED照明，解决了传统IDT的一些限制问题。
该文章中提出的方法主要面临两个问题。其一，物镜的色差将导致从一副彩色图像中分离出的三幅准单色图像在焦平面处错位。同时，由于环形LED的RGB通道具有不同的半径，在高NA成像情况下，实验中任何照明角度偏离或焦平面位置的轻微变化都会使傅里叶频谱信息混乱。因此，用于单波长照明IDT的4D传递函数模型不适用于彩色照明，而且不正确的传递函数将在反卷积过程中产生重建伪影，从而降低最终的成像分辨率和轴向重建深度。为了解决这个问题，作者提出了一种互相关算法来确定每个彩色通道在彩色复用照明下的焦平面的等效位置。
同时，LED位置的横向错位也会降低3D RI 图像的质量，并且不正确的角度也会导致严重的重建伪影。为了解决这个问题，在实验中采用了一个三轴唯一平台，使光源与光轴中心对称。之后利用数字自校准程序来准确地校正LED环形光源中每一个光源的空间位置（如图1(d)）。
图1. 色差和LED空间位置校准。(a) 利用R/G/B通道图像在焦平面上重建硅藻细胞的结果; (b) 互相关算法匹配物镜色差参数; (c) 消除色差后在焦平面上的硅藻细胞的重建结果; (d) 在空间频率坐标中绘制的LED位置; (e) 校正的4D传递函数。
图2. sIDT成像系统中的彩色复用照明示意图。(a) sIDT系统，包括一个标准倒置显微镜、一个可编程环形LED光源和一个彩色相机; (b) 从环形LED光源中发出的三色光同时照明样品，调整距离使照明角度与目标NA相匹配; (c) 获得的彩色强度图像; (d) 与彩色强度图像中分离出来的R/G/B通道对应的三幅单色强度图像。
图3. MCF-7细胞3D RI 测量。(a) 用sIDT重建的大视场图像;(b)(c) (a)中两个不同区域的不同深度的层析信息的放大图像;(d-g) 比较不同深度细胞内结构的线轮廓。
图4. 利用sIDT重建螺旋藻样品的3D RI。(a) 彩色复用照明模式和相对应的3D傅里叶频谱;(b) 利用三帧sIDT算法对螺旋藻RI进行三维渲染结果;(c) 用一帧或三帧sIDT恢复了不同深度的RI分布的四个x-y方向切片;(d) 沿着x-z和y-z方向的两个RI切片;(e1)和(e2)在(c)和(d).中对应的线轮廓。
图5. 使用sIDT对线虫RI进行动态成像。(a) 在2.12s内不同时刻恢复的线虫位置结果;(b-c) (a)中放大图像的不同深度信息。
在该项工作中，作者提出了一种基于彩色复用的单次曝光强度衍射层析显微术，可以实现对无标记动态样品的高分辨率3D RI成像。与已有的强度衍射层析方法相比，该方法提高了3D成像的速度，并通过自校准算法和互相关算法补偿了4D传递函数在横向和轴向上的错位。此外，结合相机的最大帧率带宽限制和三帧交替照明模式，实现了沿横向方向的各向同性傅里叶覆盖和实时成像。理论分析和实验结果表明，sIDT是一种具有广泛前景的3D成像技术，在生物医学和生命科学等方面具有重要应用价值。
文章链接：
https://doi.org/10.1364/OL.442171
