封面 | 生物体多维成像“利器”：多模态非线性光学显微成像技术

图1 NLOM发展历程

在生物组织成像中，不同的生物分子具有不同的非线性光学特性。不同的非线性光学成像模式具有分子特异性和选择性，能够实现具有亚细胞空间分辨率的非接触式实时生化信息获取。随着人们对生命科学研究的不断深入，非线性光学成像技术的应用范围也在逐渐扩大，而生物样本的结构与功能的复杂性需要从不同维度进行多参量信息的获取，以实现对复杂生物过程的深入研究。因此，生物医学领域迫切需要能够获取多维度生化信息的光学成像技术，以实现对生物组织的多参量表征，获得更为全面的微观结构特性和功能信息。

非线性光学成像技术主要包括二次谐波产生（SHG）、三次谐波产生（THG）、双光子激发荧光（TPEF）、三光子激发荧光（3PEF）、相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）和受激拉曼散射（SRS）显微成像等，已经成为了在微米和纳米水平上检测生物分子、细胞和组织的重要工具，其发展促进了生物学、药学和医学基础研究的进步。集成多种非线性成像技术的多模态光学表征系统的研究与开发成为了近年来光学显微技术发展的新方向，多重非线性对比机制能够对生物组织进行多参量多维光学表征，进而获得更为全面的生物微结构与生物分子代谢信息以用于生物医学研究。

2.1 非线性光学显微成像技术的多模式耦合

目前，基于多光子激发荧光、SHG与THG的多模态非线性光学成像因其激发条件与探测方式的高度兼容性而被广泛应用于生物医学领域。然而，因多光子激发荧光和谐波产生过程与相干拉曼成像具有不同的激发条件，故集成SRS与荧光寿命显微镜（FLIM）成像的多模态非线性成像仍存在巨大挑战。通过偏振分离、时间延迟和空间重叠等方法能够解决多模态光学成像在激发与探测方面的同步问题，通过协调检流振镜驱动与多种非线性信号同步采集、SRS光谱扫描和FLIM同步成像等硬件逻辑控制问题可实现多种非线性成像模态的信息同时获取，如图2所示。

图2 集成TPEF、SHG、SRS和双光子荧光寿命显微镜（TP-FLIM）的多模态非线性光学成像系统

2.2 多模态非线性光学显微成像系统的优化

基于不同非线性光学对比机制的高分辨多模态非线性光学显微成像方法在生物医学中已经得到了广泛的应用，提高成像速度以实现高通量光学成像是技术创新的重要方向。数据吞吐量的提高对快速动力学过程研究、快速临床诊断研究，以及生物体复杂功能信息研究等都具有重要意义。在不考虑延长像素驻留时间以确保图像信噪比的情况下，可通过提高扫描器的速度和并行探测成像这两种方式来提高非线性光学显微镜的吞吐量。多模态非线性光学显微成像系统可与受激辐射损耗(STED)、结构光照明显微成像（SIM），以及随机光学重构显微技术（STORM）等超分辨技术和深度学习算法结合，进而实现空间分辨率的提高。此外，深度学习的引入也能够助力多模态非线性光学成像突破成像速度、视场、空间分辨率和图像信噪比间的固有限制，使其成为无创评估疾病、神经活动和胚胎发生的有力工具。

2.3 多模态非线性光学内窥镜

在活体成像研究中，通常将非线性光学成像与内窥镜技术相结合以灵活地实现对活体生物表皮与内部器官的动态监测。非线性光学内窥镜的扫描机制如图3所示。多模态非线性光学内窥镜的关键技术包括：

1）将具有超短脉冲宽度的激发激光束以最小损耗传输至样品端，同时能够高效收集微弱的非线性光学信号；

2）在这种微型仪器中采用的激光扫描机制应该允许尺寸缩小到毫米级，并能够实现监测生物过程的快速扫描速率；

3）基于微光学的非线性光学内窥镜的设计应保持较大的灵活性和紧凑的尺寸，以便利用内窥镜对内部器官进行成像。

通过使用大模场光子晶体光纤、空心光子晶体光纤和双包层光子晶体光纤可以显著减少超短脉冲传输所消耗的时间和抑制超短脉冲传输过程中的光谱增宽。特别是，双包层光子晶体光纤可以同时实现高效的脉冲传输和非线性信号采集。同时，将用于二维扫描的基于压电驱动器或微机电系统的微型扫描机构与用于光束聚焦的基于梯度折射率透镜的微型物镜结合，最终实现了多模态非线性光学内窥系统，目前已广泛应用于深部脑组织和胃、食管等内脏组织成像。

图3 非线性光学内窥镜的扫描机制。（a）结合光纤束传导的近端扫描；（b）通过压电驱动器的机械共振实现光纤尖端扫描；（c）微机电系统用于远端扫描

多模态非线性光学显微成像技术能够利用不同非线性成像对比机制对生物体进行多维光学表征成像，并具有衍射极限空间分辨率、光学切片效果、大的穿透深度、小的光损伤以及分子特异性。多种非线性成像模式能够对组织内荧光团（NADH、FAD）、胶原蛋白、微管、肌球蛋白、脂质、蛋白质以及微环境信息进行可视化和定量。将不同成像技术与相应的定量分析方法结合能够从多个信息维度对生物体组织结构与生理动态过程进行成像表征，使得该技术成为了非线性光学显微成像发展的重要分支，被广泛应用于细胞检测、癌症诊断以及脑成像研究等生物医学领域，尤其在临床病理学诊断中具有较大的潜力。在未来的发展中，可通过提高成像速度来满足生物动态过程的多参量信息监测，可借助内窥成像技术将该方法进一步应用于活体动物模型，并且可与深度学习方法结合来进一步优化系统参数和进行多维度信息融合。