共聚焦显微镜凭借其对各种样品成像时所具有的灵活性和可靠性，目前仍然是生物医学光学显微镜中的主力。 但是其存在点扩散函数各向异性、分辨率衍射受限、散射样品中与深度相关的退化(degradation)和体积漂白等问题。
基于此，美国国立卫生研究院的Yicong Wu(一作兼通讯)等人提出一种多视图(multiview)共聚焦显微镜，在空间上从亚微米到毫米，在时间上从毫秒到小时级地增强共聚焦显微镜的性能。轴向和横向分辨率提高两倍以上的同时，还降低了光毒性。主要举措有：
(1)、开发紧凑型线扫描仪，能够在大面积上实现灵敏、快速、衍射极限的成像；
(2)、将线扫描与多视图成像相结合，开发可提高分辨率各向同性并恢复因散射而丢失的信号的重建算法；
(3)、采用结构光照明显微技术，在密集标记的厚样品中实现超分辨率成像；
(4)、结合深度学习，进一步提高成像速度、分辨率和持续时间。
作者对20多个不同的固定和活样本进行成像实验，包括单细胞中的蛋白质分布；秀丽隐杆线虫胚胎、幼虫和成虫的细胞核和发育中的神经元；果蝇翅膀成虫盘中的成肌细胞；以及小鼠肾脏、食道、心脏和脑组织等。
将多视图成像，结构光照明超分辨，基于深度学习的降噪、解卷积、图像分割、超分辨预测相结合，获得具有高性能的多模成像显微镜。
(1)成像装置。405nm、488nm、561nm、647nm半导体激光器各自经过半波片和二向色镜后，合束进入声光可调谐滤光器(AOTF)。AOTF对入射光进行开关和功率控制。随后，AOTF的出光经过两个分光棱镜分成三束光，由反射镜和振镜反射耦合进标号为A、B、C三条宽带单模光纤，振镜用于调节耦合进光纤的光功率。每一条宽带单模光纤出光各自耦合进一个共焦扫描模组，每个模组都包含一个MEMS线扫描仪、耦合光路、物镜、卷帘相机。A、B、C三个模组按顺序轮流采集。每个模组实行线扫描，卷帘相机的行扫描和线扫描照明对应，实现共焦。
(2)采用去噪、三视图解卷积模型，从低信噪比的各个视图图像获得高信噪比的三视图解卷积图像，因为结合了三个视图的信息，相比单视图图像，其分辨率的各向同性能力得到提升。在此基础上，应用分割网络区分细胞核。低信噪比图像的应用，意味着可以使用更弱的激发光和更快的采集速度，因此成像速度和光毒性都能得到改善。
(3)多视图结构光照明超分辨。在三个正交方向上扫描线照明，每个方向采集5张产生均匀相移的图像，平均处理后产生衍射极限图像。检测每个照明最大值并重新分配其周围的荧光信号(光子重新分配)，可提高线扫描方向上的空间分辨率。组合从多个视图获取的图像体积进一步提升体积分辨率。举例说明，体积分辨率提升5.3倍：从335nmX285nmX575nm提升到225nmX165nmX280nm。
(4)动态三维结构光显微成像。一维结构光使得采集速度下降了15倍(因为每个方向采集5张图，共三个方向)，因此不适合实时超分辨应用。在这里，训练一个残差信道注意力网络(residual channel attention neTWork, RCAN)从衍射极限输入预测一维超分辨图像。当训练数据所用样本的方向是随机的时候，只需要旋转输入图像，然后重新作为训练好的网络输入，再结合联合解卷积，即可将一维超分辨拓展到二维超分辨。
附图：
视频：
表达Lifeact tdTomato的U2OS细胞三视图二维SIM和原始视图比较
参考文献：Wu, Y., Han, X., Su, Y. et al. Multiview confocal super-resolution microscopy. Nature (2021).
DOI：https://doi.org/10.1038/s41586-021-04110-0
