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多焦点球差光场成像拓展三维景深范围 (PhotoniX)

多焦点光场显微成像技术

 

Multi-focus light-field microscopy for high-speed large-volume imaging
本期导读

 

对大范围高动态生物现象进行三维高速成像对于人们探索生命系统至关重要。在过去几十年里，研究者们开发了多种快速、高分辨率的体成像方法，其中光场显微技术（light-field microscopy, LFM）由于其高并行性和低光毒性受到研究者的青睐。然而，LFM的分辨率与体积覆盖率相互制约，阻碍了其在大轴向范围样本观测中的应用。
近日，来自清华大学脑与认知科学研究院（THUIBCS）的研究团队提出了一种球差辅助扫描光场成像方法（Spherical-Aberration-assisted scanning LFM, SAsLFM）。利用折射率不匹配引入附加球差实现多焦点扫描光场感知，同时不需要额外的硬件辅助。通过球差所引入的天然相位调制将不同子孔径分量焦点的轴向位置进行再分配，充分利用光场冗余的角度信息，将成像体的高分辨景深扩展了三倍，同时减少了原焦平面附近的伪影。
该研究进行了大量的生物实验展示了SAsLFM的成像性能：包括对300μm厚的活体小鼠脑进行高信噪比钙信号提取，以22Hz的体成像速率在2000×2000×500μm3的视野范围内对自由移动水母进行动态追踪等等。进一步，该研究还通过深度学习方法将重建速度提升3个数量级，实现了大通量三维信息实时可视化。该研究于2022年11月发表于《PhotoniX》。

多焦点球差光场成像拓展三维景深范围 (PhotoniX)

图1. 该研究于2022年11月发表于《PhotoniX》。

技术背景

 

神经元的钙离子瞬变、血管运输和胚胎发育等三维生物的大时空尺度复杂现象需要高速体积成像技术进行观测。在过去的几十年里，研究者们开发了多种快速、高分辨率的体成像方法，其中光场成像技术（LFM）由于其高并行化和低光毒性成为了一种快速体积成像的强大工具。通过在光路中加入微透镜阵列（microlens array, MLA），LFM可以在单次拍摄中对三维空间内的高维光信息进行编码。通过配套的反解算法，可以以高保真度还原场景的三维信息。然而，LFM仍然受到时空分辨率和体积覆盖率之间的相互制约，阻碍了LFM在大范围活体场景下的应用。为了突破这一限制双聚焦微透镜阵列和共聚焦光场显微系统等方法可以扩展轴向高分辨率范围，但同时牺牲了系统的复杂度。因此，如何低成本地扩大光场成像的高分辨率范围仍然是一个具有挑战性的问题。
技术路线

 

非聚焦扫描光场显微系统往往含有几十个甚至上百个子孔径分量（图2a）。在理想系统中，不同子孔径分量对应的高分辨率轴向范围完全相互重叠，因此存在大量的数据冗余。在对光场成像的物理模型进行分析后，研究人员发现在相空间下，不同子孔径分量之间保持相对独立，可以通过特定的相位调制将不同子孔径的焦点位置进行快速重排，以此扩展单次采集的轴向高分辨率范围。球差作为一种常见的光学畸变，在传统的光学成像中并不受欢迎。但在光场成像系统中，添加球差是一种简单有效的实现多焦点的方法。如图2b所示，在光瞳面上加入一个理想的中心对称球差，各子孔径分量的聚焦深度由子孔径位置与光瞳面中心的相对距离决定，导致各子孔径分量的轴向高分辨率位置偏移，能量被重新分布。最后通过适当的重建算法合并所有角度的信息，则可以获得具有扩展景深的高分辨率大尺度重建体（图2c）。

多焦点球差光场成像拓展三维景深范围 (PhotoniX)

图2. SAsLFM原理。(a)  SAsLFM示意图（扫描周期为3×3）。与每个微透镜中心有相同相对位置的像素被重新排列在一起，形成子孔径分量。(b) 子孔径光路编码示意。不同子孔径的光线在入水时改变了它们原来的方向，最终聚焦在不同的深度。经过球差调制后，子孔径点扩散函数(point-spread-function, PSF)的强度分布发生了变化。(c) 重新排列的SAsLFM图像的子孔径分量根据对应的子孔径位置被分为几组。同一组内的分量包含从特定深度范围内获得的高分辨率内容。通过相空间重建算法可以充分恢复子孔径数据中包含的高分辨率三维信息。

研究人员首先使用10×/0.28NA长工作距离空气物镜对USAF-1951分辨率板成像，来定量说明SAsLFM的成像性能。重建结果如图3a-b所示，与sLFM相比SAsLFM在轴向上显著扩大了高分辨率覆盖范围。SAsLFM在-600~200 μm的轴向范围内维持了高于3.91 μm（第七组，元素一）的分辨率水平（图3c-d），并削弱了焦面处的伪影。

多焦点球差光场成像拓展三维景深范围 (PhotoniX)

图3. 位于不同深度的USAF-1951分辨率板的重建结果。(a-b) 用sLFM和SAsLFM获得的USAF-1951分辨率板的重建结果的比较。SAsLFM的高分辨率范围在焦面一侧有明显的延伸。(c) a和b中的方框标记的放大视图。SAsLFM能够重建远离焦面的信息。(d) 在不同的轴向位置，sLFM和SAsLFM的分辨率曲线。在大约1 mm的大轴向范围内，SAsLFM比传统的sLFM保留了更多的细节。比例尺：50 μm。
在扩展轴向高分辨率范围的同时，SAsLFM还具有高速和低光毒性的成像优势，因此尤其适用于观测生物样本中的大尺度三维结构和动态。研究者使用SAsLFM对多种模式生物进行成像，包括对斑马鱼全身脉管系统重建，对小鼠脑进行大范围(2000×2000×330μm3)钙信号提取以及对果蝇卵的发育过程进行长时(~6.5 h)观测等。此外，研究人员还对自由活动的水母水螅体进行三维追踪(图4)。之前相关的研究需要采用一定的方式将水母固定，以此保证水母在有限的成像范围内。而SAsLFM拥有大尺度高分辨的视野范围，因而可以允许样本在一定范围内自由活动。
该研究在2000×2000×500μm3视野范围内以22Hz对自由活动的水母水螅体进行高速体成像，并且成功追踪到了水螅体触手的三维运动轨迹(图4c)。此外，随着计算硬件的不断改进和多种方法的开源，深度学习已经成为图像解卷积的有力替代方法。研究者通过基于U-Net的相空间解卷积算法，实现了实时三维信号可视化。

多焦点球差光场成像拓展三维景深范围 (PhotoniX)

图4. (a) 水母水螅体三维重建结果。(b) 自由活动的水母水螅体在不同时刻的强度投影。(c) SAsLFM实现了对8个触手三维运动跟踪，不同点代表了每个触手在不同时间段的空间位置。

简要小结：光场成像本身就能显著的提升三维成像景深，该研究工作进一步挖掘了以往一直被尽量避免的光学球差，能够天然将不同子孔径信号聚焦在轴向的不同位置，实现了低成本的多聚焦光场成像而不需要应用不同焦距的微透镜阵列，将景深范围进一步增大了三倍，实现了超大轴向范围内的高速三维感知。同时这一方法能够与扫描光场技术有效的结合，显著提升空间分辨率。该研究成果为未来探索更复杂的编码光场成像打开了新的大门，在生命科学、医疗诊断和其他需要超大景深范围的领域将有很好的应用前景。

论文信息：

  • Zhang, Y., Wang, Y., Wang, M. et al. Multi-focus light-field microscopy for high-speed large-volume imaging. PhotoniX 3, 30 (2022).

     

  • https://doi.org/10.1186/s43074-022-00076-y

     

技术详见：
Multi-focus light-field microscopy for high-speed large-volume imaging | PhotoniX
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