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动态相位切换技术助力三维受激辐射显微镜成像的高信噪比呈现（ACS Photonics）

动态相位切换助力自适应光学三维受激辐射显微镜成像去背景

 

Accurate Background Reduction in Adaptive Optical Three-Dimensional Stimulated Emission Depletion Nanoscopy by Dynamic Phase Switching
本期导读

 

三维受激辐射损耗（Three-Dimensional Stimulated Emission Depletion, 3D-STED）是实现细胞结构亚百纳米分辨率三维成像的一种重要荧光显微术，但是其成像质量常常受限于较低的信背比（Signal-to-Background Ratio, SBR）。近年来，研究者们提出了不少软硬件去背景方法，但相关方法较为复杂，有效性、准确性有待提高。

 

近日，来自浙江大学的研究人员将自适应光学技术与光场调控技术结合，利用变形镜和空间光调制器相位调制元件，实现了高信背比的多色三维超分辨显微成像。该研究为解决3D-STED显微成像中背景较高的问题提供了一种新的思路，有望在细胞生物学、生命科学等领域得到应用。研究成果于12月发表在《ACS Photonics》期刊，被选为当期封面文章。

 

动态相位切换技术助力三维受激辐射显微镜成像的高信噪比呈现（ACS Photonics）

技术背景

 

3D-STED是实现细胞结构亚百纳米分辨率三维成像的一种重要荧光显微术，通过损耗荧光发光区域的外围荧光并保留中心荧光，将发光区域限制在衍射极限以下，从而实现三维超分辨成像。为此，损耗光需要聚焦成一个中心光强为零的三维中空暗斑，该暗斑可以通过对两束非相干的损耗光分别加载涡旋相位和环形相位得到。由于该暗斑外围光强低和光学像差的存在，外围荧光常常不能被完全损耗掉，从而产生离焦背景。这一现象在对厚样品三维成像时尤为严重。另一方面，为了追求更高分辨率而采用更高损耗光强，则会导致反斯托克斯激发从而产生荧光背景。
技术路线

 

该研究首先呈现了自主搭建的多色自适应光学3D-STED显微镜（图1a）。该显微镜引入了变形镜（Deformable Mirror, DM）和空间光调制器（Spatial Light Modulator, SLM）这两个相位调制元件，通过调制激光或者荧光的波前分布，可以方便地校正系统像差和样品像差，有效提升了采集到的荧光强度（图2），并获得了约65nm的三维分辨率。但是，上述背景噪声的存在限制了图像质量（信背比）的进一步提升。

 

动态相位切换技术助力三维受激辐射显微镜成像的高信噪比呈现（ACS Photonics）

图1. DPS-STED原理图

为进一步提升信背比，该研究提出了动态相位切换去背景方法（DPS-STED）。该方法的工作原理如图1b所示，通过改变空间光调制器上加载的涡旋相位的旋向和环形相位的内径，使得损耗光聚焦成一个不完美的暗斑（中心光强非零）。在这种不完美的暗斑作用下，中心荧光（信号）被完全损耗掉，从而只探测到了常规图像中背景部分，实现了背景与信号的准确分离。随后，将此背景以一定的比例系数从常规图像中减去，从而得到无背景的超分辨图像。该比例系数取决于所拍摄的常规图像和背景图像，可通过算法自主确定。

动态相位切换技术助力三维受激辐射显微镜成像的高信噪比呈现（ACS Photonics）

图2. 自适应光学（Adaptive Optics, AO）技术对成像质量的提升

该方法随后在实验上得到了验证，对不同的细胞器进行了单色或多色成像。通过相位的动态切换，实现了常规图像和背景图像的交替拍摄。同时，背景图像比常规图像拍摄时间更短，可以有效减少光损伤和成像时间。

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图3. 微管三维成像结果

图3所示的是微管的三维成像结果。可以看到，在细胞核附近区域，微管空间分布更为密集，采集到的常规图像背景也更大，像一层“迷雾”笼罩在微管上。采用上述DPS-STED方法获得的图像，使得微管分布更为清晰明了，信背比（SBR）也获得了3倍的提升。

 

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图4. 线粒体三维成像结果

    图4所示的是线粒体的三维成像结果。可以看到，该方法的去背景能力十分显著，更为清楚地展示线粒体的外膜结构。同时，与其他算法去背景的方法（RBA、WBS）相比，该方法信背比提升更为优越（共计884个不同信背比的常规图像用作分析）。图5所示的是核孔复合物（NPC）和高尔基体（Golgi apparatus）的双色三维成像结果。可以看到，该方法很好地呈现了这两种结构的超分辨和高信噪比三维成像。

动态相位切换技术助力三维受激辐射显微镜成像的高信噪比呈现（ACS Photonics）

图5. 核孔复合物和高尔基体三维成像结果


简要小结：该研究将自适应光学技术与光场调控技术结合，利用变形镜和空间光调制器相位调制元件，实现了高信背比、高分辨率的多色三维超分辨显微成像。相比于其他去背景的方法，该研究提出的动态相位切换去背景方法具有容易实现、灵活有效的优点。展望未来，该方法可进一步应用于活细胞三维超分辨成像，相减系数确定方法也可以应用于其他减背景方法。

论文信息：

  • S. Tu, X. Liu, D. Yuan, W. Tao, Y. Han, Y. Shi, Y. Li, C. Kuang, X. Liu, Y. Yao, Y. Xu, and X. Hao, “Accurate Background Reduction in Adaptive Optical Three-Dimensional Stimulated Emission Depletion Nanoscopy by Dynamic Phase Switching,” ACS Photonics 2022 9 (12).
技术详见：
https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acsphotonics.2c00957
*该技术分享所涉及文字及图片源于发表论文和网络公开素材,不做任何商业用途。

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