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介绍一篇能够延长焦深的散斑照明超分辨成像技术文章：
标题：Extended-depth of field random illumination microscopy, EDF-RIM, provides super-resolved projective imaging
地址：doi.org/10.1101/2023.10.30.564754
代码：github.com/teamRIM/tutoRIM.
在实现超分辨率的各种方法中，结构照明显微镜（SIM）在时空分辨率和光毒性之间呈现出良好的平衡。在SIM中，超分辨率图像是使用通过平移和旋转的周期性照明图案获得的多个低分辨率图像通过算法重建得到的。SIM适合实时成像，并已在多种模式中实现：光片显微镜、全内反射显微镜、3D显微镜。然而，SIM数据处理需要非常准确地了解照明图案信息，这使得该技术对像差敏感并破坏了其在生物组织中适用性。因此，现在较为活跃的研究领域有两个方向：其一是改善照明图案，并开发自适应光学方法或后处理算法，以纠正潜在的伪影。其二是SIM的变体，称为随机照明显微镜(RIM)。RIM用随机散斑照明取代了周期性图案。它使用基于原始图像的二阶统计的重建过程，避免了SIM依赖于照明图案信息的缺点。RIM已被证明具有强大的抗像差能力，与标准显微镜相比，横向分辨率提高了两倍，同时还提供了强大的轴向切片能力。
目前SIM受限于焦深，仍无法在大体积成像中广泛使用，扩展景深(EDF)成像正逐渐变得更加重要。第一种方法使用包括可调谐透镜、声透镜或可变形镜等快速扫描成像平面。第二种方法使用点扩散函数（PSF）工程，例如激发PSF可以使用贝塞尔光束，检测PSF也可以使用相位掩模来延长焦深。EDF成像很有吸引力，但受到背景及其相关泊松噪声的影响，从而使照明图案的对比度变暗。这种对比度损失以及可能较厚的样本引起的照明图案失真限制了经典SIM在扩展景深成像系统中的效果。因此，作者表示尚不知道有任何适用于活体生物样本的超分辨率大景深显微镜技术。
在本文中，作者首次使用RIM将超分辨率技术与扩展焦深相结合。该技术包括使用多个斑点照明来照亮样品，并使用具有EDF能力的检测方案来收集光。超分辨图像是使用图像和散斑的二阶统计从原始图像重建得到的。证明RIM重建过程可以有效地消除了EDF图像中通常存在的背景噪声，并提高了横向分辨率，使其超出了衍射极限。
【系统光路】
本文将散斑照明与焦深延长技术相结合，具体来说，焦深延长是通过两种互补策略实现的：（1）使用相位掩模将焦深扩展大约三倍；（2）电可调镜头（ETL）在相机曝光周期内沿轴向快速扫描成像。阶梯相位掩模（DoubleHelix PNDT6）和电可调透镜（Optotune EL-10-30-Ci 系列）放置在fR1（Thorlabs AC254-125-A-ML）、fR2（Thorlabs AC254-125-A-ML）间的光瞳平面中。这两种焦深延长方法具有相似的光学布局，其中显微镜检测光路中的继电器用于将掩模或ETL放置在与物镜光瞳共轭的平面上（图1A）。在轴向焦点扫描时，单次相机曝光内向ETL发送扫描电流信号，有效地对多个平面上的荧光信号求和以实现焦深的扩展（图1B）。与ETL相比，使用掩模的优点是不需要沿轴向扫描，但只能用于浅深度（~1.5μm）成像。TEL轴向扫描可用于更大的深度（＞20μm）。图1C和1D分别为激发散斑的(x,y)和(x,z)截面。图1E对比了宽场显微镜的2D PSF和本文提出的EDF-PSF，后者具有显著的分辨率和背景优势。
图1. (A)光学系统原理图。散斑是通过漫射器或空间光调制器生成的。检测光路包括：4f光路（fR1、fR2），用于扩展检测PSF的相位掩模或用于执行快速轴向焦点扫描的电可调透镜，两者均放置在光瞳平面中。(B)采集序列时序。顶线代表与相机共轭的z平面，使用ETL时在相机曝光时间内快速扫描（红线），或者使用相位掩模（黄带）时保持在恒定范围。(C,D)XY和YX平面内的照明散斑示例。插图为散斑自相关函数Гs(x,y,0)和Гs(x,0,z)。(E)宽场显微镜的2D PSF与EDF-PSF之间的比较，后者是由3D-PSF沿z轴的积分获得。
第一种方法在显微镜成像光路的光瞳平面处插入阶梯相位掩模（图2A）。在这样的相位掩模中，来自每个同心子孔径的贡献（具有轴向延伸的PSF）非相干地累加成组合PSF，该组合PSF轴向延伸且横向保持狭窄。图2B 表示有和没有相位掩模的检测 PSF(detection PSF)，说明了存在掩模时的焦深得到了轴向延伸。随着 PSF (∼1.5µm) 轴向范围增加约三倍，现在可以在单个平面中捕获生物样品中的 PSF (∼1.5µm) 结构，而传统 RIM 需要沿轴向扫描多个平面。图 2C、C’ 比较了带有（左）和不带有（右）掩模的小鼠肠上皮桥粒（desmosome）的图像。由于样品的形貌略有弯曲，EDF-RIM可见的一些结构在传统2D-RIM中明显缺失。2C和C’之间的缩略图可以清晰对比EDF-RIM和2D-RIM具有非常相似的横向分辨率。
图2. 用于分子成像的带有相位掩模的EDF-RIM。(A)在显微镜成像光路的光瞳平面中插入阶梯相位掩模。(B)有和没有相位掩模的显微镜PSF对比。(C)使用(C)和不使用(C’)相位掩模的小鼠肠上皮桥粒RIM图像的比较。(C)由于焦深延长从而捕获了更多结构（左侧和底部）。(C)和(C’)之间的插图对比了不同方法的局部放大图：顶部，EDF宽场图像；中部，EDF-RIM；底部：2D-RIM。比例尺300nm。
简而言之，作者将三项技术结合：RIM实现超分辨成像，相位掩模实现约3倍的焦深延长，电动可调透镜实现更大的轴向扫描成像。更多散斑照明超分辨图像重建理论细节与成像效果，请阅读原文。
