超分辨显微术：打破Abbe衍射极限的桎梏

自1873年Abbe等推导出衍射极限¹以来，光学显微镜的分辨率在接下来的一个多世纪中未能取得根本性突破。然而，对于高分辨率的追求从来就没有停止。最终，经过不懈努力，科学家在20世纪90年代取得突破。由于衍射极限的存在，可见光波段范围内的显微镜分辨率一直被限制在250 nm以内。超分辨显微术的出现使得人类终于打破这一桎梏。得益于过去20年超分辨显微术的进步，现阶段已经可以实现在xy平面和沿z轴将分辨率分别提升6~10倍。

备注1：早在1835年，英国科学家George B. Airy就提出了“Airy斑”理论：基于光的衍射特性，即使一个无限小的发光点在通过透镜成像系统后，也会形成一个弥散的图案，称为“Airy斑”。Airy光斑在成像平面附近的三维的光强分布被称为光学系统的“点扩散函数”（point spread function，PSF）。随后在1873年，著名的德国科学家Ernst Abbe基于此原理提出了“Abbe光学衍射极限理论”（diffraction limitation），经典的公式也作为其重要成就刻于其墓碑上。

图1 Ernst Abbe墓碑及其著名的光学衍射极限https://en.wikipedia.org/wiki/Diffraction-limited_system

需要强调的是，超分辨显微术并非特指某项技术，而是若干种不同技术方案的总称¹，例如“4Pi显微技术”、“基态损耗显微技术”（Ground State Depletion microscopy，GSD）、“受激辐射损耗显微成像技术”（STimulated Emission Depletion, STED）、“（饱和）结构光照明显微技术”（(saturated) Structured Illumination Microscopy, (s)SIM/NL-SIM)）、“随机光学重构显微技术”（Stochastic Optical Reconstruction Microscopy, STORM）等。但是，无论具体实现方式如何，这些技术在本质上是相通的：各种技术都由光强调制，并且非线性地开关荧光染料分子以实现对荧光辐射的操控，继而在时间上依次记录整个观察区域内的细节²。正是由于这些技术能够提供突破衍射极限的分辨率，才使首次使用光学显微镜进行许多生命科学研究成为可能。

1 Xiang Hao, Yiming Li, Shuang Fu, Yanghui Li, Yingke Xu, Cuifang Kuang, Xu Liu.Review of 4Pi Fluorescence Nanoscopy[J].Engineering,2022,11(4):146-153.

2 Sigal, Y.M., R. Zhou, and X. Zhuang, Visualizing and discovering cellular structures with super-resolution microscopy. Science, 2018. 361(6405): p. 880-887.

1 荧光显微镜与Abbe衍射极限

在过去的几十年里，荧光显微镜已经成为生物科学的重要工具。与其他技术（如电子显微镜）相比，荧光成像可观察正在培养中的细胞，这使得光学显微术在跨度时间尺度上观察成为可能。

就空间分辨率而言，正电子发射断层成像、磁共振成像和光学相干断层成像这几种技术可生成分辨率在10厘米和10微米之间的动物和人类图像，而电子显微镜和扫描探针技术具有最高的空间分辨率，通常接近分子和原子水平（见图2）。在这两个极端的分辨力之间是光学显微镜。

荧光显微镜对我们理解生物系统的分子结构和相互作用至关重要。除了能够对活细胞进行成像的优势外，所有形式的荧光显微镜（包括宽视场、激光扫描、旋转盘、多光子和全内反射）的最重要的缺点是空间分辨率的限制，这些限制是由Ernst Abbe在19世纪末首次阐明和描述。

图2 各种显微术在生物学中的观察尺度范围

目前，现代成熟的荧光显微镜技术可以很容易地分离细胞和组织中的各种特征，如细胞核、线粒体、高尔基复合体、细胞骨架和内质网。荧光中的各种成像模式经常被用来动态追踪蛋白质和信号肽，以及监测活细胞中的其他相互作用。然而，有限的空间分辨率排除了解决重要结构的能力，包括突触小泡、核糖体或分子间的相互作用，这些结构的大小范围都在荧光显微镜的检测极限之下。

光学显微镜的衍射极限是由以下决定：当对点光源成像时，仪器在图像平面上产生一个模糊和衍射的有限大小的焦斑，其尺寸决定了可以区分两点的最小距离。在横向（x,y）平面上，焦斑的特征是逐渐缩小的外部同心环，被称为艾里盘，而在轴向尺寸上，椭圆图案被称为点扩散函数（PSF）。

Abbe提出的光学显微镜中横向和轴向分辨率的正式表达式是：

分辨率x，y = λ/ 2[ηsin(α)]  (1)

分辨率z = 2λ/ [ηsin(α)]2   (2)

其中λ是光的波长（荧光中的激发），η代表成像介质的折射率，组合项ηsin(α)被称为物镜数值孔径（NA）。

显微镜中常用的物镜的数值孔径小于1.5，限制了公式（1）和（2）中的项α小于70度（尽管新的高性能物镜接近这个极限）。因此，当使用数值孔径为1.40的物镜时，在最短激发波长（约400nm）的理论分辨率极限在横向尺寸上约为150nm，在轴向尺寸上接近400nm。就活细胞中增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的实际成像而言，这些数值分别约为200和500nm（见图2（a））。因此，无论是使用宽视场还是共聚焦荧光显微镜，都无法在横向平面上分辨出距离超过200nm的结构。

 图3 光学显微镜的横向和轴向分辨率限制及光学传递函数（OTF）

2 Abbe衍射极限有可能被突破吗？

对于Abbe衍射极限的认识已经存在近一个世纪，然后富有创造力的显微镜专家开始研究如何改进他们的仪器，以绕过物理障碍，从而获得更高的分辨率。由于轴向分辨率远远低于横向分辨率（至少是2倍），20世纪后半叶进行的许多工作都是为了改善轴向的性能。

研究人员发现，激光扫描共聚焦仪器以牺牲信噪比为代价，使分辨率有了非常小的提高，其他相关技术（包括多光子、旋转盘）也能用光学切片，但在轴向分辨率方面没有明显改善。需要注意的一个重要概念，也是生物学中的光学成像最不被重视的事实之一，就是实际的显微镜分辨率往往达不到衍射所带来的物理极限¹。

备注1：这是由于样品中的光学不均匀性会扭曲激发光束的相位，导致焦点体积明显大于衍射极限的理想值。此外，显微镜的不正确校准、使用不兼容的浸泡油、盖玻片的厚度超出最佳范围以及校正不当也会影响分辨率。

光学显微镜中限制分辨率的另一个重要方面表现为仪器光学传递函数（OTF），这可以用点扩散函数的傅里叶变换来计算。OTF定义了包含样品信息的空间频率在成像过程中丢失、保留、衰减或相位偏移的程度（图3（b））。成像过程中丢失的空间频率信息无法恢复，因此所有形式的显微镜的主要目标之一是尽可能从样品中获取最高频率范围。

在传统的荧光显微镜中，为了实现这一目标，普遍的要求是确保发射的荧光与激发照明的局部强度呈线性比例。然而，与透射光和反射光的情况不同，由于大的光谱带宽和电子弛豫产生二次光子的随机性，荧光发射是不连贯的。

3 光学显微镜革命：超分辨率显微镜

在20世纪90年代初，由Stefan Hell、Mats Gustafsson、David Agard和John Sedat开发的具有对置物镜的仪器（技术命名为4Pi和I⁵M）能够分别使用共聚焦和宽视场配置将轴向分辨率提高到100nm左右。然而，即使这些仪器能够提高五倍的轴向分辨率，横向分辨率仍然没有得到改善。在20世纪90年代后期，由Stefan Hell开创的新显微镜技术能够克服Abbe横向分辨率的衍射限制，这最终导致了荧光显微镜的革命。

因此，最近推出了一系列令人振奋的新方法，现在统称为超分辨率显微镜，其特点是横向和轴向分辨率都在几十纳米甚至更低。所有这些新技术的共同点是，它们能够通过按时间顺序打开和关闭荧光团来解决衍射极限以下的特征，从而可以连续记录信号。

超分辨率成像的最重要进展是在所谓的远场显微镜中实现的，涉及空间或时间上调节荧光团的两个分子状态之间的转换（如在暗态和亮态之间切换），或通过物理上减少激发照明中使用的点扩散函数（PSF）的大小。

在通过修改点扩散函数（PSF）来提高分辨率的方法中，最重要的技术被称为缩写STED（受激辐射损耗；来自Stefan Hell实验室）和SSIM（（饱和）结构光照明显微技术；由Mats Gustafsson首创）。依靠检测和精确定位单分子的技术包括PALM（光激活定位显微镜；由Eric-Betzig和Harald-Hess介绍）和STORM（随机光学重建显微镜；由庄小威¹首次报告）。

备注1：庄小威，1972年1月出生于中国江苏省如皋市，生物物理学家，美国国家科学院院士、美国艺术与科学学院院士、美国国家医学科学院院士、中国科学院外籍院士，哈佛大学化学与化学生物、物理学双聘教授。庄小威主要研究工作为发展和使用单分子生物学及生物成像技术以及超高分辨生物成像技术，用以研究体外及活细胞中生物分子及其分子组装过程

这些技术有许多变种，以及可以结合甚至改善现有成像方案性能的先进方法。更重要的是，新的超分辨率技术正以几乎令人惊叹的速度被引入（相对于传统的显微镜技术的进步），并且认为在不久的将来的某个时刻，单纳米的分辨率很可能在商业仪器中实现，这不是没有道理的。

图4 各类超分辨显微术的技术特点https://ibook.antpedia.com/x/469350.html

4 受激辐射损耗显微术（Stimulated Emission Depletion, STED）

STED超分辨显微术是基于1994年提出的理论模型发展起来的。该技术首先于1999年被实现并被用于材料学研究，并随即在2000年实现了在生命科学领域的应用。自此，STED彻底改变了荧光成像的范式。STED是首个被实现的基于目标开关原理的超分辨显微术。

受激辐射损耗显微术（STED）是一种荧光显微镜技术，它克服了共聚焦显微镜的衍射分辨率限制。分辨率的提高主要是通过在衍射受限的激发焦点外部区域使用强激光刺激发射来关闭染料分子的荧光。这种强烈的辐射会使几乎所有的激发分子返回基态，然后检测激发焦点中心剩余受激染料分子的荧光，并利用这些荧光形成高分辨率图像。

通过对收集到的数据进行时间开关（gated STED , gSTED）处理，可以进一步提高分辨率。由于STED能有效缩小观测范围，在这种情况下，在不同的观察体积直径下收集数据，有助于看清楚生物膜等异质样品中复杂的二维扩散情况。

 图5 激光共聚焦与受激辐射损耗显微术的分辨率差异

STED 方法使用成对的同步激光脉冲。第一个激光脉冲由皮秒脉冲二极管激光器等产生，用于激发荧光染料并产生普通的衍射有限聚焦。激发脉冲之后紧接着是耗尽脉冲，耗尽脉冲的频率与染料的发射光谱重合。通过使用专门设计的相位板将STED脉冲空间排列成甜甜圈形状，只有来自激发焦点外围分子的荧光才能通过受激发射淬灭。在甜甜圈的中心，STED 激光强度为零，荧光不受影响，并由单光子敏感探测器检测到。

图6 受激辐射损耗显微术STED的原理https://www.picoquant.com/applications/category/life-science/sted

5 4Pi 荧光超分辨显微术与STED技术结合

由于大部分生物结构都具备三维空间分布，因此，将超分辨率成像扩展至三维水平，可以清晰地显示这些生物体结构或记录分子运动。将原有的二维超分辨显微成像扩展至三维水平有多种技术实现路径。

对于单分子定位显微术（SMLM），如光激活定位显微术（PALM）、随机光学重构显微术、荧光激活定位显微术（fPALM）而言，可以采用双焦面成像或者点扩散函数（PSF）操控的方法；对于以受激发射损耗显微术（STED）、可逆饱和光学荧光跃迁显微术为代表的目标开关超分辨显微术而言，最常用的策略则是同时使用两个相位板，通过非相干叠加的方式来创造一个三维中空的STED/RESOLFT聚焦光斑。

然而，无论使用哪种技术，最终能达的分辨率仍然取决于显微镜聚焦光斑的锐利程度。这一事实导致的后果便是：相对而言，轴向分辨率的提高比横向（焦平面内）分辨率的提高更加困难。因此，即使通过超分辨显微术可以将横向分辨率提升到20~40nm，但是同一架构下达到的轴向分辨率仍然比横向分辨率低（后者约是前者的2.5倍）。

对于光镜而言，单个透镜只能覆盖半个球面波波前，除非刻意牺牲横向分辨率，否则要做到三维各向同性是非常困难的。如果存在一个光学系统，能够收集焦面之后的另外半个球面波波前，由于对称性的恢复，系统PSF的形状就可以（基本上）保持为一个球形。基于上述思想，在20世纪90年代早期，Hell等发明了基于两个对置物镜的4Pi显微镜。在实际应用中，一个物镜大约只可以覆盖65°的半孔径角，使用两个物镜则可以几乎完整覆盖整个4 π的立体角（实际应该为2.5 π~3 π）。

图7 图1. 4Pi显微镜的简化架构与原理示意图。（a）简化架构示意图。（b）在轴向平面（xz平面）内的4Pi显微镜PSF。上下两个物镜的PSF相干叠加压缩了整个PSF的轴向尺寸。（c）不同4Pi架构的有效PSF。从左至右：A型架构，激发光相干；B型架构，发射光（荧光）相干；C型架构，两者同时相干。APD：雪崩光电二极管；BS：50/50分光镜；DM：二向色镜；L：透镜；M：反射镜；SM：扫描镜。

4Pi显微术与超分辨显微术的结合可以进一步提高系统的三维分辨率，特别是轴向分辨率。

过去15年的技术进步已经使STED显微术迈进了三维成像的新纪元。在众多具体的实现方法中，基于两个对置物镜的4Pi架构，由于可以在轴向生成非常锐利的STED聚焦暗斑而尤为引人注目。虽然其分辨率优势没有得到充分的发挥，但是早期的所谓STED-4Pi显微术已经能够在焦平面附近提供约33nm的轴向分辨率。而作为其改良版本的isoSTED显微术则已能提供各向同性的三维高分辨率图像。

图8. isoSTED显微镜在材料科学中的应用。（a）透射电镜（TEM）下所展现的溶剂退火薄膜的层状结构。（b）相同样品在共聚焦显微镜下的成像结果，未显示任何细节。（c）在isoSTED显微镜下层状结构得到清晰展现。

6 超分辨显微术的发展与未来

超分辨率荧光显微镜改变了人们对许多生物系统结构和功能的认识。然而，挑战依然存在，要最大限度地发挥超分辨率显微镜的影响，还需要进一步的技术进步。

超分辨率显微镜在生物系统中实现的空间分辨率通常在10nm到70nm之间，大于大多数生物分子。实现真正的分子尺度分辨率（约1nm）可直接探测细胞内的分子相互作用和构象，但这仍是一项具有挑战性的任务。

原则上，克服衍射极限的两大类光学方法，包括以 STED、RESOLFT和NL-SIM 为代表的图案照明法和以STORM、PALM 和 PAINT为代表的单分子开关法，都能达到无限高的分辨率。然而，一些实际因素，如提高照明强度（前者）和增加荧光体光子预算（后者）以获得更高分辨率的要求，限制了可实现的分辨率。

此外，虽然超分辨成像在某些情况下具有亚秒级甚至毫秒级的时间分辨率，但由于空间分辨率和时间分辨率之间的权衡、荧光团有限的光子预算以及对样品的光毒性，长时间高时空分辨率的活细胞成像仍然困难重重，也是一个正在积极开发的领域。此外，尽管在消除组织引起的背景、像差和光散射方面做了大量工作，但深入组织内部的活体超分辨率成像仍具有挑战性。

另一个挑战，同时也是一个令人兴奋的新方向，是增加可同时成像的分子种类数量。细胞中含有数千种不同的基因和其他分子，它们共同作用产生行为和功能，但多色成像通常只能同时观察到少数不同的分子种类。

最近的进展在这一方向上有了新的突破，基因组规模的成像现在已经触手可及。例如，单细胞转录组成像方法通过使用多重荧光原位杂交（FISH）或原位测序，可同时对单个细胞中1000 个或更多基因的 RNA 进行成像。未来，DNA 和蛋白质也可能达到类似的多重性水平。将这些方法与超分辨率显微镜相结合，有可能实现基因组尺度的超分辨率成像。在技术上，基因组尺度成像的一个主要挑战是分子拥挤，这可能会阻碍传统成像对相邻分子的分辨，而超分辨显微镜则提供了一个很有前景的解决方案。

从生物学角度看，对复杂分子机制或整个信号通路中的所有分子进行成像的能力，以及最终在全基因组尺度上进行成像的能力，将为细胞行为和功能的分子基础提供全面的图景。令人振奋的是，想象一下这样一幅细胞图景——所有分子都以能够直接推断分子相互作用的分辨率成像——将为在分子水平上理解生命带来新的机遇。

参考资料

1 Xiang Hao, Yiming Li, Shuang Fu, Yanghui Li, Yingke Xu, Cuifang Kuang, Xu Liu.Review of 4Pi Fluorescence Nanoscopy[J].Engineering,2022,11(4):146-153.

2 Sigal, Y.M., R. Zhou, and X. Zhuang, Visualizing and discovering cellular structures with super-resolution microscopy. Science, 2018. 361(6405): p. 880-887.

3 https://zeiss-campus.magnet.fsu.edu/

4 Liu, Sheng, Philipp Hoess, and Jonas Ries. “Super-resolution microscopy for structural cell biology.” Annual review of biophysics 51 (2022): 301-326.

5 Vangindertael, Jeroen, et al. “An introduction to optical super-resolution microscopy for the adventurous biologist.” Methods and applications in fluorescence 6.2 (2018): 022003.