光学显微镜的分辨率受到衍射极限的限制，只能达到 ~ 200 nm 的分辨率。在最近二十年中，STED、SIM、PALM/STORM、DNA-PAINT 等一系列技术，通过点扩展函数（point spread function, PSF）的调制，突破了光学衍射的限制，使光学分辨率最低达到 20 nm，得到广泛的生物应用并获得 2014 年的诺贝尔化学奖。
那么分辨率到底有没有极限？2017年，诺贝尔奖得主 Stefan Hell（STED 技术的发明人）又发展了 MINFLUX 技术（MINimal photon FLUXes, 最低光子数显微成像），进一步提升了光学分辨率，可以获得 ~ 1 nm 的定位精度和 ~ 5 nm 的空间分辨率。MINFLUX 作为单分子定位技术，结合了 STED 与 STORM 两种技术的特点。与 STED 的淬灭光使用甜甜圈（donut）形状的中空光斑不同的是，MINFLUX 使用 donut 光斑作为激发光；类似 GPS 定位的原理，MINFLUX 使用甜甜圈光斑对荧光分子进行多次成像，进而可以通过统计学方法，估计出荧光分子的位置。
空间分辨率可被认为与定位精度成正比关系。也就是说，通过提升定位精度，可以进一步提高空间分辨率。~ 1 nm 的定位精度，已经与单个分子的大小十分接近；但空间分辨率并未达到分子大小，仍有提升的空间。是否有新的方法，可以进一步提升定位精度，从而提升空间分辨率呢？
北京大学的席鹏实验室在理论上提出，如果将双光子激发（TWo-photon excitation, TPE）用于 MINFLUX 技术中，可以再将定位精度和分辨率提高 2 倍，获得小于 1 nm 的定位精度。
该文章认为，双光子 MINFLUX（Two-photon MINFLUX, 2p-MINFLUX）不仅可以提升 2 倍的定位精度，同时可以具有更为直接的多色成像能力。
来自阿根廷生物科学研究中心的 Fernando D. Stefani 教授为本文撰写了 News & Views，以 Multiphoton single-molecule localization by sequential excitation with light minima 为题发表于 Light: Science & Applications。（论文网址：https://doi.org/10.1038/s41377-022-00763-2）
MINFLUX 的技术原理关键在于，donut 光斑零点附近的梯度，远高于高斯光（Gaussian beam）顶点附近的梯度。MINFLUX 使用 donut 零点附近进行定位，即可降低定位所需光子数量、提高定位精度。
文章认为，由于双光子激发的非线性效应，荧光强度正比于激发光强度的平方，于是 donut 零点附近的梯度将被进一步提高（图1）。对比 2p-MINFLUX 和传统 MINFLUX，在采集到同样荧光光子数的条件下，2p-MINFLUX 理论上可以获得 2 倍的定位精度提升；若为获得同样定位精度，2p-MINFLUX 只需要 1/4 的光子数即可实现。
图1：单光子和双光子 MINFLUX 的定位精度比较。梯度（斜率）变为原来的 2 倍，置信区间的宽度变为了原始的一半，即精度提升 2 倍
MINFLUX 的定位精度通过 C-R 下界（CRB, Cramér–Rao Bound）表示。文章通过数学推导，严格的证明了双光子效应使 CRB 变为原来的 1/2，即定位精度提高了 2 倍，该提升对 xyz 三个维度均成立。
文章进一步分析了多种实验参数对定位精度的影响，包括荧光光子数、偏置长度、信背比等。与现有 MINFLUX 技术（1p-MINFLUX）相同，在 2p-MINFLUX 中，信背比决定了偏置长度的最小值，最终限制了可获得的定位精度。而实际上，双光子技术的特性之一，即是降低焦点外的荧光背景。由于双光子激发只发生在焦点，三维空间其他位置没有激发，双光子 MINFLUX 具有比单光子 MINFLUX 更低的背景，可能进一步提高定位精度。为了直接对比双光子 MINFLUX 和现有 MINFLUX 技术的性能，在模拟中各参数的数值选取均保持一致。
文章模拟了 2p-MINFLUX 和现有 1p-MINFLUX 成像过程和结果，并进行对比（图2）。一方面，在 2p-MINFLUX 和 1p-MINFLUX 采集到同样荧光光子数的条件下，1p-MINFLUX 无法分辨的结构，可由 2p-MINFLUX 分辨（图2b vs c）。另一方面，在 2p-MINFLUX 和 1p-MINFLUX 达到同样定位精度时，2p-MINFLUX 只需要 1p-MINFLUX 的 1/4 的光子数（图2b vs d）。
图2：双光子 MINFLUX 的模拟成像结果。该结果直观体现了 2p-MINFLUX “定位精度 2 倍”和“光子数 1/4 倍”的关系
文章最后讨论了实验可行性。文章认为由于双光子荧光速率（fluorescence rate）低于单光子荧光，2p-MINFLUX 的荧光速率预计是 1p-MINFLUX 的一半。同时，与 1p-MINFLUX 相对于共聚焦成像提高了激发光强相同，2p-MINFLUX 的激发光光强，相对于双光子成像也预计需要提高 1 个数量级。此外实验中也需要注意双光子激发波长的选择，其对光斑质量和多色能力均会存在影响。
总而言之，MINFLUX 技术的分辨率可以由双光子非线性效应所提升，可以提升 2 倍的定位精度和分辨率，或者降低 4 倍的所需荧光光子数。荧光显微镜的分辨率可以进一步接近单个分子大小的极限。
作者最后展望，由于双光子非线性效应的存在，2p-MINFLUX 将可能具有更为直接的多色成像能力；同时，2p-MINFLUX 不仅可以作为超分辨成像手段，也可作为高速多色单分子追踪的方法。该技术可以进一步促进生物医学领域的基础研究，尤其是生物互作方面诸如核酸-蛋白互作、病毒-细胞互作的研究。
Zhao, K., Xu, X., Ren, W. et al. Two-photon MINFLUX with doubled localization precision. eLight 2, 5 (2022).
