超分辨显微成像，看清生命微观世界

大脑是人体中最复杂最精密的器官，小小的脑袋里除了装满了智慧，还装载着860亿个大脑神经元。哺乳动物的大脑涉及记忆、认知和感觉等高级功能，并且与许多精神疾病相关联。然而，目前人类对这一部分的研究和理解存在局限，对大脑的研究仍是一个长期的探索过程。研究大脑，先要“看清”大脑，光学成像技术虽能够以一种直观的方式呈现出大脑中的神经、血管等结构，但是由于光学衍射极限，普通光学显微镜的分辨率高于200 nm，无法区分大脑中的神经突触等精细结构，从而限制了对大脑功能活动的研究。

超分辨显微成像技术的出现使得纳米级的光学成像成为可能。2014年诺贝尔化学奖授予了Eric Betzig，Stefan W. Hell，William E. Moerner三位科学家，表彰他们在超分辨荧光显微成像领域做出的卓越贡献。发展至今，已经出现了受激辐射损耗（STED）显微镜、结构光照明显微镜（SIM）、随机光学重建显微镜（STORM）等超分辨成像技术。这类技术被广泛应用到各个领域，尤其是生物医学。超分辨技术通过纳米尺度成像，不仅能观察到细胞骨架等细微结构，还能以亚细胞水平研究生命活动，为生命微观世界的探索打开了一扇新窗口。

将超分辨显微成像技术应用于大脑的活体成像，能够为大脑结构和功能的研究提供纳米尺度的观察工具。超分辨成像技术可以区分微血管、神经元突触、树突棘等精细结构，同时在活体水平上研究大脑的功能活动。在传统多光子成像技术的基础上引入超分辨率显微成像技术，结合穿透深度和空间分辨率的优势，可以进一步扩大超分辨脑成像的范围，在神经科学、脑疾病研究等领域具有重要价值。

大脑是一个十分复杂的神经网络，大脑皮层作为大脑的外层结构，是神经元胞体集中分布的区域，在生物的运动控制、感觉体验和记忆等功能中起着关键作用。对大脑皮层成像，不仅能直观地呈现神经网络的结构，还能结合动物行为研究大脑的功能活动，为治疗人类脑部疾病做出重要贡献。

在活体水平对动物大脑成像需要克服组织光散射、成像速度和光毒性等诸多因素。尽管已经有许多种超分辨荧光显微成像技术，但能够成功实现活体大脑成像的仍然较少。近十几年来发展的超分辨显微成像技术主要包括基于光斑调控技术的STED和SIM，还有基于单分子定位技术的STORM和光活化定位显微成像(PALM)等。后者需要牺牲时间分辨率来获取高空间分辨率，成像速度较慢，难以直接应用到监测活体大脑活动。目前，用于活体大脑成像的超分辨技术主要是STED和SIM。

1）受激辐射损耗（STED）技术

STED成像是应用于活体大脑成像的最主要技术，基本原理如图1所示，其中一束激光被聚焦成正常的衍射极限焦斑,使焦斑内的荧光分子处于激发态，另一束波长较长的激光(通常位于发光材料发射光谱的红外末端，称为“退激发光”或“STED光”)使激发态的电子以受激发射损耗的方式回到基态，并发出一个与STED光波长相同的光子。经过相位调制后，STED光的光斑中心为零点, 形成经典的甜面包圈，光斑中心没有退激发现象。将激发光与退激发光斑重叠，只有STED零点位置的荧光物质发光，从而实现超分辨。

作为STED技术的提出者，诺奖获得者Stefan W. Hell最先报道了活体大脑超分辨成像的研究。以至少70 nm的横向分辨率记录了成年小鼠躯体感觉皮层的树突棘活动，如图1（b）所示。随后，Hell团队在之后在小鼠大脑成像中展开了更多研究，如引入可光切换探针进一步实现多标记的STED成像。

2）结构光照明显微成像（SIM）

SIM是一种基于莫尔效应的成像技术，如图2（a）所示。采用调制光照明，使照明图案与样品图案叠加，产生莫尔条纹。莫尔条纹比样品图案更容易被观察，同时叠加图案又包含照明光和样品的信息，从而可以根据已知的照明图案计算出原始的样品图案。与其他超分辨显微成像技术相比，SIM在空间分辨率上的提升有限，但SIM操作简单，最大限度地利用了荧光分子，极大降低了照明功率，能够实现长期的活体成像，用途广泛，在活细胞和活体成像领域占据着重要地位。

值得注意的是，目前报道的将SIM应用于活体大脑成像的研究仍然较少。一个可能的原因是传统的SIM成像的空间分辨率被限制在衍射极限的一倍提升（约100 nm）。目前，SIM已经发展出了一些更高分辨率的变体，有望得到广泛应用。此外，在进行大尺寸成像时，SIM比基于点扫描的STED显微镜更能适应高速成像。

3）结合多光子成像技术

在活体水平进行光学脑成像面临的最主要也是最难以解决的问题是组织光散射。随着成像深度的增加，组织对光的吸收和散射作用导致光信号衰减。其中，近红外波段的激发光可以减少组织的光吸收，降低生物组织的自发荧光，从而减少背景信号。红光(600~700 nm)和近红外光被称为细胞和组织的“光学窗口”，在这个范围内，组织和细胞对光的吸收较弱，不仅能降低组织的光损伤，还能提高光的穿透深度。

除了增加激发光的波长外，其他多光子技术也能提供解决问题的方案。图3（a）对比了单光子和双光子吸收及其荧光激发的空间分布。双光子成像基于非线性激发，仅在焦平面处激发荧光，能够实现光切片效果，减少了离焦平面的荧光干扰，并且还能减少对组织的光毒性。传统的单光子成像采用可见光激发，通常只能达到100 μm的成像深度。而多光子成像技术采用长波长激发光（如700~1000 nm），具有更高的穿透深度，可以实现近1 mm的成像深度，图3（b）展示了用双光子对小鼠大脑神经成像的效果。

作为传统的活体大脑成像的主要方法，多光子成像技术也是极具吸引力的超分辨技术结合对象。目前，STED和SIM与双光子成像技术的组合已经有了相关的研究。尽管如此，目前这些组合成像技术还没有实现“协同效应”，例如双光子STED（2P-STED），双光子SIM（2P-SIM）。虽然它们在一定程度上提高了成像深度，但深度还没有超过120 nm，这并没有达到理想的双光子成像效果。

受到组织光散射和活体运动等因素影响，活体大脑超分辨成像还面临许多挑战。除了光学成像中对成像速度、成像深度和成像时间的要求之外，荧光探针和动物的状态也同样需要考虑。其中，成像速度与成像体积相互制衡；成像深度因为组织的光散射而受到限制；成像时间由成像技术等因素决定；荧光探针的选择将影响成像系统、成像效果和实验的设计；动物的状态则进一步影响成像的信噪比以及成像的时间。因此，要同时实现多个高指标是十分困难的，往往需要根据具体的成像需求做出取舍，以最大限度地发挥成像系统的性能。